HPV18E7重組質粒的構建及在大腸桿菌中的表達優化＊

胡仁建，蔡家利△，劉 利，涂漫語，徐 濤，杜翠容，羅 佳，丁 森

（1.重慶理工大學藥學與生物工程學院 400054；2.南京大學生命科學學院 210093）

高危型人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）持續感染宮頸是引起宮頸癌及癌前病變的直接病因［1］。HPVE7蛋白為宮頸癌發展的潛在標志物，可以用新型雙抗夾心酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法檢測到各型HPV的重組E7蛋白以及宮頸涂片和宮頸癌細胞裂解物中的HPVE7蛋白［2］。HPV很難在體外培養成功［3－5］，HPV18整合在 HeLa細胞株的染色體［3，6］，本研究利用基因重組技術，構建 HPV18E7基因的重組質粒，并探索HPV18E7基因的優化表達，為探索新的簡單有效的檢測宮頸涂片中的HPV18E7蛋白的診斷方法奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和材料 大腸桿菌DH5α和BL21－DE3－pLysS由重慶市富進生物技術有限公司惠贈，組織／細胞DNA小量抽提試劑盒購于上海華舜生物技術有限公司，質粒抽提試劑盒和膠回收試劑盒購于OMEGA公司，質粒載體pET－32a（＋）購于Novagen公司，HPV18E7引物委托上海博尚生物技術有限公司合成，工具酶PrimeSTARRHS DNA Polymerase、NcoⅠ、XhoⅠ、T4DNA Ligase等購于大連寶生物技術有限公司。

1.1.2 主要儀器 Thermo Hybaid公司的2×P梯度PCR儀，BIO－RAD電泳儀及電泳槽等。

1.2 方法

1.2.1 pET－32a（＋）－HPV18E7重組質粒的構建 利用軟件分析HPV18E7全基因的序列后設計一對特異性引物。以提取的HeLa細胞株的DNA為模板PCR擴增HPV18E7基因。將HPV18E7基因和載體pET－32a（＋）進行酶切及連接。

1.2.2 感受態細胞的制備與重組質粒的轉化 用氯化鈣法制備DH5的感受態細胞，將連接后的重組質粒pET－32a（＋）－HPV18E7轉化感受態的大腸桿菌DH5α，同時設置陰性對照和陽性對照。

1.2.3 重組質粒的鑒定 挑選3個單菌落，提取質粒，進行了PCR鑒定、雙酶切鑒定和DNA測序。

1.2.4 HPV18E7基因在大腸桿菌中的優化表達 在LB培養基中，誘導起始A600為0.6～0.8，用異丙基－β－D－硫代吡唃半乳糖苷（IPTG）和乳糖兩種誘導劑，IPTG誘導濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0mmol／L，乳糖濃度0.10、0.25、0.50、1.00g／L，4個誘導溫度：20、24、30、37℃，以空載體為空白對照，誘導前和誘導后2、4、6h取樣，所有的十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酶胺凝膠（SDS－PAGE）電泳結果顯示目的蛋白的表達量不高。據F.William Studier的自誘導策略的成功［7］，嘗試用為自誘導培養基ZYM－5052時，結果顯示有大量的目的蛋白表達。

2 結 果

2.1 HPV18E7基因的PCR擴增結果 梯度PCR結果顯示除64.2℃的退火溫度不能擴增出目的基因以外，退火溫度分別為：64.5、65.1、65.7、66.5、67.3、68.1、69.0、69.6、69.9、70.1℃均能擴增出與目標基因HPV18E7（大小為318bp）大小一致的片段，且特異性較好，無其他雜帶的出現。見圖1。選擇69℃為退火溫度大量PCR擴增目標基因HPV18E7。

圖1 HPV18E7基因的梯度PCR擴增核酸電泳圖

2.2 重組質粒pET－32a（＋）－HPV18E7的PCR鑒定 以3個克隆的重組質粒pET－32a（＋）－HPV18E7為模板，用HPV18E7特異性引物PCR擴增HPV18E7基因，有3個克隆的重組質粒能夠擴增出相對分子質量大小與HPV18E7基因一致的條帶，見圖2。

圖2 重組質粒pET－32a（＋）－HPV18E7的PCR鑒定圖

2.3 重組質粒pET－32a（＋）－HPV18E7的雙酶切鑒定 用NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切3個經PCR鑒定有目標基因的重組質粒pET－32a（＋）－HPV18E7，核酸電泳顯示有與質粒pET－32a（＋）和目標基因HPV18E7的相對分子質量大小一致的條帶出現。見圖3。

2.4 重組質粒pET－32a（＋）－HPV18E7的DNA測序 先將3個經PCR鑒定和雙酶切鑒定有目的基因的重組質粒pET－32a（＋）－HPV18E7送大連寶生物公司測序，有2個質粒中HPV18E7序列與HeLa細胞中的HPV18E7序列一致，有1個質粒有1個堿基變異。另外提取3個質粒，DNA測序，經比對后發現這3個質粒中的目標基因HPV18E7的序列與模板HeLa細胞中的HPV18E7序列一致。選擇其中任何一個質粒轉化感受態的大腸桿菌BL21－DE3－pLysS制備成工程菌用于表達HPV18E7致癌蛋白。

圖3 重組質粒pET－32a（＋）－HPV18E7的雙酶切鑒定

圖4 用IPTG和乳糖誘導表達時無明顯的HPV18E7融合蛋白出現的SDS－PAGE圖

2.5 重組質粒pET－32a（＋）－HPV18E7在大腸桿菌中的優化表達 在LB培養基中，用IPTG和乳糖，在不同溫度、不同誘導劑濃度、不同時間等任何一個條件誘導，然后經SDS－PAGE電泳，結果顯示均無明顯的目的蛋白出現。見圖4。在自誘導培養基ZYM－5052中，選擇4個誘導溫度20℃、24℃、30℃、37℃，任何一個溫度的SDS－PAGE蛋白電泳顯示：與空載體pET－32a（＋）－BL21－DE3－pLysS相比，pET－32a（＋）－HPV18E7－BL21－DE3－pLysS誘導前即0h、誘導2h未見與目標蛋白相對分子質量大小一致的條帶，4h均開始出現新的相對分子質量約33×103的條帶，誘導18h的量明顯多于誘導4h的量，HPV18E7融合蛋白出現在上清中，顯示HPV18E7基因表達的融合蛋白為可溶性表達，見圖5。空載體pET－32a（＋）表達的蛋白相對分子質量約為20×103，HPV18E7蛋白的相對分子質量約為13×103，重組質粒pET－32a（＋）－HPV18E7表達的融合蛋白的相對分子質量大約33×103，正好與新出現的條帶相對分子質量一致。

經硫酸鎳親和層析初步純化HPV18E7融合蛋白（因為載體pET－32a（＋）本身帶有6個組氨酸標簽，可以與硫酸鎳結合），SDS－PAGE蛋白電泳顯示用含50mmol／L咪唑和75 mmol／L咪唑的洗脫液不能洗脫表達的融合蛋白，用含200 mmol／L咪唑和500mmol／L咪唑的洗脫液可以洗脫，加上相對分子質量與目標蛋白的相對分子質量一致，說明500 mmol／L咪唑洗脫的蛋白為目標融合蛋白。見圖6。

圖5 ZYM－5052誘導 pET－32a（＋）－HPV18 E7－BL21－DE3－pLysS表達圖

圖6 硫酸鎳親和層析初步純化HPV18E7融合蛋白的電泳圖

3 討 論

3.1 重組質粒pET－32a（＋）－HPV18E7的構建構建HPV18E7基因時，設計針對HPV18E7全長基因的特異引物，目的是希望獲得HPV18E7全長天然蛋白，以此天然蛋白篩選的單抗能更好特異結合宮頸涂片中表達的天然的HPV18E7蛋白。選擇載體pET－32a（＋）是因為它帶有T7強啟動子、帶有融合標簽（Trx.Tag、His.Tag、S.Tag等）可使目的HPV18E7蛋白可溶性的持續性表達，而且在設計引物時使表達的初始2個氨基酸（蛋氨酸和纈氨酸）為非極性氨基酸時會提高表達量。采用梯度PCR探索出最佳的退火溫度并大量擴增特異HPV18E7基因，為后續的酶切、連接、鑒定等奠定基礎。特別強調的是在回收PCR產物、酶切后的產物時一定要迅速，避免在紫外線下暴露時間過長會引起的點突變。

3.2 重組質粒pET－32a（＋）－HPV18E7的優化表達探索pET表達系統為T7誘導系統，用IPTG誘導存在不足［8］。本研究實驗證明，在LB培養中，用IPTG誘導HPV18E7基因，無論選用哪種溫度、何種誘導濃度、何種起始量，以及誘導時間長短都未見有HPV18E7融合蛋白的明顯表達；用傳統的乳糖誘導方法無論在哪種條件下，都未見有HPV18E7基因的明顯表達。美國布魯克黑文實驗室的Studier提出了自誘導表達策略這一理論并實踐成功［7］。彭淑英等［9］啟用自誘導表達系統提高了表達的效率。本研究采用了Studier的自誘導不固定型組分培養基ZYM－5052，的確獲得大量的呈可溶性表達的HPV18E7融合蛋白，大大超過用IPTG和乳糖誘導的結果，再次證明了自誘導表達策略的確可以提高外源基因在原核系統的表達效率。

培養基ZYM－5052包含細菌生長的各種營養成分和自誘導因素，包括葡萄糖和乳糖，葡萄糖消耗完畢后乳糖誘導作用開始。使用自誘導培養基ZYM－5052操作簡單，表達效率高，價格便宜，易于推廣。

后續的純化實驗表明表達的融合蛋白可以用硫酸鎳親和層析純化得到，且相對分子質量的大小與HPV18E7融合的相對分子質量大小一致，證實了表達的融合蛋白確實是目標蛋白。初次純化的HPV18E7蛋白的純度雖然遠遠不夠，但可以通過提高硫酸鎳親和層析柱的柱效以得到純度高的融合蛋白，為后續的腸激酶酶切HPV18E7融合蛋白奠定基礎。

［1］Burd EM.Human papilomavirus and cervical Cancer［J］.Clin Microbiol Rev，2003，16（1）：1－175.

［2］Ehehalt D，Lener B，Pircher H，et al.Detection of human papillomavirus type 18E7oncoprotein in cervical smears：a feasibility study［J］.J Clin Microbiol，2012，50（2）：246－257.

［3］李忠明，張延齡，徐德啟，等.當代新疫苗［M］.北京：高等教育出版社，2001：509－514.

［4］Yan J，Harris K，Khan AS，et al.Cellular immunity induced by a novel HPV18DNA vaccine encoding an E6／E7fusion consensus protein in mice and rhesus macaques［J］.Vaccine，2008，26（40）：5210－5215.

［5］金奇.醫學分子病毒學［M］.北京：科學出版社，2001：812－831.

［6］Masters JR.HeLa cells 50years on：the good，the bad and the ugly［J］.Nat Rev Cancer，2002，2（4）：315－319.

［7］Studier FW.Protein production by auto－induction in high density shaking cultures［J］.Protein expression and purification，2005，41（1）：207－234.

［8］馮彬.T7表達系統及自誘導蛋白產出策略［J］.教育學院管理學報自然科學版，2009，4（3）：10－15.

［9］彭樹英，呂寧，賈淑玲，等.應用自動誘導表達體系提高原核表達效率［J］.農業生物技術學報，2009，17（1）：138－143.