YB－1基因沉默抑制前列腺癌細胞的增殖和遷移＊

張 濤，何平平，周 俊，羅志剛，歐陽新平

（南華大學：1.附屬第二醫院泌尿外科；2.護理學院；3.附屬第二醫院檢驗科；4.醫學院生理學教研室，湖南衡陽 421001）

Y－盒結合蛋白1（Y－box binding protein－1，YB－1）是 Y 盒蛋白家族的成員之一，廣泛分布于原核和真核生物細胞中，參與了多種生物學過程［1－2］。研究表明YB－1與人類惡性腫瘤的關系密切，在多種惡性腫瘤中YB－1表達上調，特別在前列腺癌和乳腺癌中［3－5］。YB－1的表達水平隨腫瘤的惡性程度和病情的惡化而增加［5］。然而YB－1是否影響前列腺癌的遷移與侵襲目前還不清楚。因此本文構建了針對YB－1的siRNA重組質粒，觀察RNA干擾沉默YB－1表達對前列腺癌株PC－3細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 前列腺癌PC－3細胞株（北京協和細胞資源中心）；質粒pGenesil－1（武漢晶賽）。YB－1特異性DNA片段（上海英駿）。脂質體LipofectamineTM 2000、Trizol、RNase抑制劑、逆轉錄酶SSRT、Taq酶、HindⅢ和EcoRⅠ限制性內切酶（Invitrogen）。兔抗人 GAPDH和 YB－1單克隆抗體以及二抗（Santa Cruz），引物（上海生工）。

1.2 方法

1.2.1 YB－1siRNA序列設計和重組質粒的鑒定 根據Gen－Bank中的YB－1基因序列，在線分析設計，確定2個靶序列，設計2個針對 YB－1的短發夾 RNA（small hair RNA，shRNA）。序列1：正義鏈5′－GAT CCG GAA GAT GTA TTT GTA CAC TTC AAG AGA GTG TAC AAA TAC ATC TTC CTT TTT TA－3′；反 義 鏈 5′－AGC TTA AAA AAG GAA GAT GTA TTT GTA CAC TCT CTT GAA GTG TAC AAA TAC ATC TTC CG－3′。序列 2：正義鏈：5′－GAT CCG GTT CCC ACC TTA CTA CAT TTC AAG AGA ATG TAG TAA GGT GGG AAC CTT TTT TA－3′；反 義 鏈：5′－AGC TTA AAA AAG GTT CCC ACC TTA CTA CAT TCT CTT GAA ATG TAG TAA GGT GGG AAC CG－3′。將合成的DNA正義鏈和反義鏈與pGenesil－1質粒連接。轉化感受態DH－5α菌種，篩選陽性克隆，搖菌抽提質粒。重組質粒和空載體進行HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切，片段大小預期分別為400和350bp。產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。2個重組質粒命名為pGenesil－1－YB－1－1（質粒1）和pGenesil－1－YB－1－2（質粒2）。

1.2.2 細胞培養和實驗分組 PC－3細胞用含10%胎牛血清的RPMI－1640培養基，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養。實驗分為4個組：未轉染質粒的PC－3細胞為空白對照組，轉染空質粒為質粒對照組，轉染重組質粒1為pGenesil－1－YB－1－1組和轉染重組質粒2為pGenesil－1－YB－1－2組。

1.2.3 重組質粒轉染PC－3細胞 提取重組質粒，測定濃度。將細胞按2×105／孔轉種于6孔培養板，細胞融合度至60%～80%時，用無血清培養基稀釋shRNA雙鏈體，將shRNA和LipofectamineTM 2000按1∶2混合，室溫下孵育20min，加入6孔板中，混勻，37℃、5%CO2培養6h后終止轉染。

1.2.4 RT－PCR 提取細胞總RNA。逆轉錄后PCR擴增。PCR條件：95℃ 變性4min，94℃30s，60℃30s，72℃35s，循環45次，72℃ 延伸5min。YB－1PCR正向引物：5′－ACA AGA AGG TCA TCG CAA CG－3′，反向引物：5′－TAA TGG TTA CGG TCT GCT GC－3′，產物長度283bp。GAPDH為內參。瓊脂糖凝膠電泳后凝膠圖像分析系統進行分析。YB－1 mRNA表達抑制率計算：抑制率（%）＝［1－（RNA干擾組條帶灰度／RNA干擾組GAPDH條帶灰度）／（對照組條帶灰度／對照組GAPDH條帶灰度）］×100%。

1.2.5 蛋白質印跡（Western blotting）法 提取細胞總蛋白，BAC法定量蛋白。100μL蛋白樣品加入到2×十二烷基硫鈉（SDS）凝膠緩沖液中，煮沸。6%SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）2h分離蛋白。分離的蛋白用半干轉膜儀轉移至聚偏二氧乙烯（PVDF）膜上。10%脫脂牛奶封閉2h，加入兔抗人 YB－1（1：200）和 GAPDH（1：300）抗體，4℃下過夜。加入二抗，4℃下孵育4h。顯影后進行半定量分析并計算蛋白表達抑制率。

1.2.6 3－（4，5－二甲基噻唑）－2，5－二苯基四氮唑溴鹽（MTT）將PC－3細胞以1×104／孔接種于96孔板，37℃、5%CO2培養24、48、72和96h。處理結束后每孔加入5mg／mL的MTT溶液20μL，培養4h。吸去上清液，每孔加入200μL DMSO，孵育10min，用酶標儀在490nm處測定吸光度A值。

1.2.7 劃痕實驗 將PC－3細胞1×105／L接種于6孔板，37℃、5%CO2培養24h。細胞在孔板的底面形成單細胞層。在單層細胞表面用100μL移液器槍頭垂直劃痕，PBS輕洗2次，除去細胞碎片，繼續培養24h，在倒置顯微鏡下觀察劃痕處細胞的遷移情況，并拍照。

1.2.8 Transwell實驗 將PC－3細胞的密度調至5×105／mL，取200μL加入上室，下室內加入600μL含100 ng／mL基質細胞衍生因子－1的培養液。37℃、5%CO2培養48h，取出上室，遷移并黏附到下室面的細胞用甲醇固定，蘇木素－伊紅（HE）染色觀察。每個小室在高倍鏡（×200）下隨機取6個視野計數遷移細胞數。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件對數據進行分析，計量資料以表示，組間比較用單因素方差分析；兩兩比較采用SNK－q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 重組質粒的酶切鑒定 重組質粒經Hind III和EcoRⅠ雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳分析可見1條約400bp的條帶。見圖1。

2.2 RNA干擾對PC－3細胞中YB－1mRNA和蛋白表達的影響 轉染48h后，與質粒對照組相比，pGenesil－1－YB－1－1組和pGenesil－1－YB－1－2組轉染的PC－3細胞的 YB－1mRNA和蛋白水平均顯著性降低（P＜0.05）。pGenesil－1－YB－1－1組和pGenesil－1－YB－1－2組 mRNA表達抑制率分別達36.23% 和39.42%，蛋白表達抑制率分別達41.56%和55.33%。質粒對照組與空白對照組相比YB－1mRNA和蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2、3。

圖1 重組質粒酶切鑒定

圖2 重組質粒轉染后48hPC－3細胞中YB－1mRNA表達

圖3 重組質粒轉染后48hPC－3細胞中YB－1蛋白表達

2.3 RNAi沉默YB－1對PC－3細胞增殖的影響 轉染48h后，與質粒對照組相比，pGenesil－1－YB－1－1組和pGenesil－1－YB－1－2組轉染的PC－3細胞的增殖能力明顯降低（P＜0.05）。而質粒對照組與空白對照組相比細胞的增殖能力差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 4組細胞不同時間A值（）

表1 4組細胞不同時間A值（）

組別0.24±0.040.35±0.050.48±0.060.64±0.08質粒對照組 0.25±0.030.33±0.050.51±0.070.62±0.07 pGenesil－1－YB－1－1組 0.18±0.020.24±0.030.31±0.050.41±0.07 pGenesil－1－YB－1－2組24h 48h 72h 96h空白對照組0.17±0.020.22±0.010.27±0.040.35±0.06

2.4 RNAi沉默YB－1對PC－3細胞遷移力的影響 轉染48h后，與質粒對照組比較，pGenesil－1－YB－1－1組和pGenesil－1－YB－1－2組細胞的運動速度均明顯減慢，pGenesil－1－YB－1－1組和pGenesil－1－YB－1－2組細胞劃痕已經基本長滿，而空白對照組和質粒對照組細胞劃痕依然明顯。見圖4。

Transwell結果顯示：與質粒對照組比較，pGenesil－1－YB－1－1組和pGenesil－1－YB－1－2組穿過濾膜的細胞數顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。空白對照組、質粒對照組、pGenesil－1－YB－1－1組和pGenesil－1－YB－1－2組穿過濾膜的細胞數分別為（123.71±13.25）、（135.73±14.18）、（67.73±8.82）和（51.73±6.75）個。

圖4 RNAi沉默YB－1基因表達對前列腺癌細胞遷移運動能力的影響

3 討 論

前列腺癌是中老年男性常見的泌尿系統惡性腫瘤。惡性腫瘤細胞的遷移和侵襲作用是腫瘤轉移的細胞學基礎。抑制前列腺癌細胞的增殖和遷移，是前列腺癌治療的重要措施。siRNA已經成為研究基因功能、病毒和腫瘤等的重要手段［6］。RNAi是由雙鏈RNA使靶mRNA發生降解而導致基因表達沉默［7］。

YB－1是最早發現的Y－盒結合蛋白家族成員，廣泛存在于從細菌到人類的許多物種中，特異性結合靶基因啟動子和增強子內部的Y－盒序列而調控靶基因的表達，參與了細胞的基因轉錄調節、mRNA選擇性剪接、翻譯調控、DAN修復、細胞再生和增殖等過程［8－9］。YB－1在惡性腫瘤的發生、發展、轉移、腫瘤治療及預后中都發揮著重要作用［10］。YB－1在前列腺癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤中高表達，YB－1表達水平高提示預后不良，被認為是腫瘤診斷的一種新型標志物［11］。siRNA可沉默人乳腺癌細胞中YB－1基因表達，并降低了細胞侵襲和成球能力［12］。這表明siRNA沉默YB－1基因能成為腫瘤治療的新策略。

在本實驗中設計并構建了2條針YB－1基因siRNA序列，分別轉染前列腺癌細胞株PC－3細胞，RT－PCR和 Western blotting檢測發現兩條siRNA都能夠有效的抑制YB－1基因的表達。2條YB－1siRNA序列均顯著抑制細胞增殖。這些結果表明YB－1siRNA序列可有效地抑制PC－3細胞中YB－1基因的表達和細胞增殖，但pGenesil－1－YB－1－2序列抑制效果更佳。這可能是由于不同細胞其靶RNA的空間構象、位點以及許多其他因素的影響所致。本研究結果表明2條YB－1siRNA序列均抑制PC－3細胞的體外侵襲力。這些結果表明YB－1基因可作為前列腺癌基因治療的靶點，為siRNA介導的前列腺癌基因沉默治療提供實驗依據，但其詳細的機制還有待于進一步研究。

總之，本研究表明siRNA沉默YB－1表達可以抑制前列腺癌細胞增殖和遷移能力。

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