蛇肽保健酒對小鼠佐劑性關節炎的影響＊

曹娟娟，和七一，趙瑛，張榮春，魏世蓉，鄒家麗，鄧可宣 ，余曉東

（重慶市動物生物學重點實驗室／重慶市生物活性物質工程研究中心／重慶師范大學生命科學學院 400047）

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性全身性自身免疫性疾病，病理基礎為關節滑膜炎，公認的RA發病的中心環節是樹突狀細胞（Dendritic cells，DCS）介導自身反應性T細胞的異常活化［1］。因臨床表現復雜多樣，加上類風濕因子（rheumatoid factor，RF）特異性較差，在其他自身免疫性疾病甚至正常人血清中都檢測得到，最終因不能及時治療而致關節功能障礙，致殘率較高，嚴重危害了人類的身體健康［2－4］。中國傳統醫學認為毒蛇及其毒性成分有祛風解毒、鎮痙止痛的功效，能治療風濕痛、四肢麻木、半身不遂等癥［5］。本實驗室研制開發的蛇肽保健酒，肽濃度18mg／100mL，乙醇濃度為35%，具有提高機體免疫能力、增強機體性功能、延緩衰老和抗疲勞等功效［6］。佐劑性關節炎（adjunctive arthritis，AA）小鼠是目前廣泛應用的類風濕性關節炎模型之一。該模型以多發性關節炎為特征，原發病變主要是局部急性炎癥反應，并于致炎后一段時間出現繼發病變，同時出現以細胞免疫變化為主的免疫功能紊亂［7］。本研究以AA小鼠為模型，研究蛇肽保健酒對AA小鼠足趾和踝關節腫脹度、體質量、脾臟指數以及血清循環免疫復合物（CIC）水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 昆明種健康雄性成年小鼠60只，體質量（20±2）g；蛇肽保健酒，酒基，弗氏完全佐劑（FCA），地塞米松片，硼酸緩沖液，聚乙二醇；濃縮儀，電子游標卡尺，電子分析天平，酶標儀。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥方式 將60只小鼠隨機分為6組，即對照組、模型組、酒基組、蛇肽低劑量組和高劑量組、陽性對照組，每組10只。除對照組注射生理鹽水外，在其他各組小鼠右后足跖皮內注射弗氏完全佐劑（FCA）0.02mL誘導炎癥發生。造模成功后第2天至34d，開始對小鼠進行灌胃，每只小鼠每天1次，每次0.2mL。陽性對照組以1mg／kg地塞米松進行灌胃，酒基組按10mL／kg灌胃，蛇肽保健酒組分別按8.3mL／kg（低劑量）、33.2mL／kg（高劑量）灌胃，對照組和模型組用純凈水對小鼠進行灌胃。

1.2.2 AA小鼠足趾和踝關節腫脹度的測定 在造模后第2、10、18、26、34天用電子游標卡尺測定各組小鼠右后肢足趾和踝關節直徑。

1.2.3 小鼠體質量和脾臟指數的測定 在造模后第2、10、18、26、34天分別稱量小鼠體質量。于末次給藥24h后，稱量體質量。之后脫頸處死小鼠，剖解剝離脾臟，稱取脾臟質量，以脾臟質量比小鼠的質量作為脾臟指數。

1.2.4 CIC的測定 造模后第34天，小鼠眼球取血，離心（3000r／min，10min）分離血清，血清用2倍體積0.1mol／L硼酸緩沖液（pH＝8.4）稀釋備用。測定管與對照管各加稀釋血清30μL，測定管加入4.1%聚乙二醇溶液300μL，對照管加入上述硼酸緩沖液300μL，混勻后4℃放置1h。用酶標儀以495nm波長測定各管吸光度（A）值，檢測結果表示為測定管A495nm－對照管A495nm。

表1 蛇肽酒對AA小鼠右后足趾腫脹度的影響（mm，，n＝10）

表1 蛇肽酒對AA小鼠右后足趾腫脹度的影響（mm，，n＝10）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與模型組比較；c：P＜0.01，與對照組比較。

組別 第1天 第2天 第10天 第18天 第26天 第34天對照組 2.29±0.02 2.29±0.02 2.16±0.04 2.36±0.04 2.44±0.07 2.45±0.01模型組 2.33±0.02 3.65±0.17c 3.33±0.10c 3.77±0.07c 3.60±0.24c 3.54±0.08c酒基組 2.32±0.04 3.67±0.14c 3.27±0.10c 3.64±0.06c 3.42±0.11c 3.43±0.07c蛇肽低劑量組 2.30±0.06 3.50±0.07c 3.28±0.07c 3.63±0.09c 3.12±0.09bc 2.92±0.06bc蛇肽高劑量組 2.30±0.06 3.62±0.14c 3.16±0.08c 3.77±0.06c 3.43±0.10c 3.35±0.10c陽性對照組 2.29±0.09 3.76±0.07c 3.14±0.09c 3.40±0.18ac 3.09±0.15ac 3.18±0.08ac

表2 蛇肽酒對AA小鼠右后踝關節腫脹度的影響（mm，，n＝10）

表2 蛇肽酒對AA小鼠右后踝關節腫脹度的影響（mm，，n＝10）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與模型組比較；c：P＜0.01，與對照組比較。

組別 第1天 第2天 第10天 第18天 第26天 第34天對照組 3.41±0.09 3.35±0.10 3.26±0.03 3.51±0.08 3.35±0.02 3.29±0.08模型組 3.35±0.04 4.24±0.10c 4.12±0.12c 4.43±0.09c 4.21±0.10c 4.25±0.07c酒基組 3.52±0.05 4.31±0.08c 3.95±0.10c 4.38±0.09c 3.92±0.09a 3.88±0.10b蛇肽低劑量組 3.43±0.07 4.32±0.07c 4.04±0.07c 4.43±0.10c 3.97±0.06a 3.82±0.08b蛇肽高劑量組 3.51±0.05 4.26±0.03c 3.90±0.06c 4.32±0.06c 4.02±0.06a 4.00±0.07a陽性對照組 3.50±0.05 4.40±0.05c 3.96±0.11c 4.07±0.11a 3.93±0.03a 3.90±0.12a

表3 蛇肽酒對AA小鼠體重的影響（g，，n＝10）

表3 蛇肽酒對AA小鼠體重的影響（g，，n＝10）

a：P＜0.05，與陽性對照組比較。

組別 第1天 第2天 第10天 第18天 第26天 第34天對照組 18.92±0.59 20.79±0.63 27.93±1.16 32.98±0.97 36.55±1.18 37.62±1.20模型組 19.00±0.30 20.43±0.43 27.34±0.73 32.44±1.71 34.74±2.04 35.93±2.31酒基組 20.08±0.35 21.40±0.31 26.22±0.88 31.99±1.36 35.56±1.21 36.81±1.11蛇肽低劑量組 19.50±0.70 20.86±0.39 26.74±1.27 34.21±1.56 38.16±1.61a 39.80±1.83a蛇肽高劑量組 19.33±0.49 20.82±0.47 25.82±1.04 32.50±0.97 36.27±1.04 37.68±1.38陽性對照組 19.42±0.47 21.00±0.56 26.23±0.99 28.95±1.93 33.68±1.43 33.33±0.67

1.3 統計學處理 數據分析采用SPSS17.0統計分析軟件，計量資料以表示，組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 蛇肽保健酒對AA小鼠右后足趾腫脹度的影響 由表1可見，從造模后第2天開始，其他各組小鼠后足趾腫脹度顯著高于對照組（P＜0.01）。與模型組比較，從給藥后第17天即造模后第18天開始，陽性對照組小鼠足趾腫脹明顯降低（P＜0.05）；從造模后第26天開始，蛇肽低劑量組小鼠足趾腫脹度顯著降低（P＜0.01）；酒基組與蛇肽高劑量組均無顯著變化。

2.2 蛇肽保健酒對AA小鼠右后踝關節腫脹度的影響 由表2可見，從造模后第2天開始，其他各組小鼠右后踝關節腫脹度顯著高于對照組（P＜0.01）。在造模后第18天，陽性對照組小鼠踝關節腫脹度顯著降低（P＜0.05）；造模后第26天，蛇肽低劑量組、蛇肽高劑量組、酒基組和陽性對照組小鼠踝關節腫脹度均顯著降低（P＜0.05）；造模后第34天，陽性對照組、蛇肽高劑量組小鼠踝關節腫脹度均顯著降低（P＜0.05），蛇肽低劑量組和酒基組小鼠踝關節腫脹度降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.3 蛇肽保健酒對AA小鼠體質量的影響 由表3可見，從造模第18天開始，與對照組比較，陽性對照組體質量增加緩慢，但未呈現顯著性差異；但蛇肽低劑量組差異有統計學意義（P＜0.05），第26天和第34天時，陽性對照組與蛇肽低劑量組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 蛇肽保健酒對AA小鼠脾臟指數的影響 造模后第34天，測定各組小鼠脾臟指數，結果顯示：與對照組（2.90±0.22）比較，模型組小鼠的脾臟指數（4.49±0.08）升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組（4.49±0.08）小鼠相比，陽性對照組（3.10±0.76）的脾臟指數顯著降低（P＜0.05）；酒基組（2.35±0.10）、蛇肽低劑量組（2.60±0.19）和蛇肽高劑量組（3.03±0.35）的脾臟指數均降低，且差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.5 蛇肽保健酒對AA小鼠血清CIC水平的影響 造模后第34天，測定各組小鼠血清CIC指數，結果顯示模型組（2.38±1.22）小鼠血清CIC指數顯著高于對照組（0.52±0.10）（P＜0.05）；與模型組相比，蛇肽低劑量組（0.65±0.14）和陽性對照組（0.37±0.09）的小鼠血清CIC指數均顯著降低（P＜0.05）。

3 討 論

3.1 蛇肽保健酒對AA小鼠踝關節和右后足趾腫脹度的影響 有研究發現眼鏡蛇毒素低、中、高劑量（2、10、50μg／kg）對大鼠右足踝關節腫脹均無顯著的抑制作用［8］。然而本研究發現：在足趾腫脹方面，陽性對照組效果顯著，蛇肽低劑量組效果極顯著。在踝關節腫脹方面，陽性對照組有顯著抑制效果，但蛇肽低劑量組效果極顯著，效果強于陽性對照組。從而說明蛇肽保健酒可明顯減輕關節炎外在癥狀，可出現受累關節腫脹減輕，防止組織局部組織損傷，對關節損傷有修復效應［9］。但同時，酒基組小鼠踝關節腫脹度也有顯著性降低。分析其原因：乙醇可以通過增強先天免疫系統細胞的功能來調節免疫反應，無論是人或是實驗動物，低濃度乙醇均可能提高其免疫功能［10－13］，從而進一步減輕踝關節腫脹。研究結果提示：地塞米松起效快，但蛇肽保健酒效果更為明顯，且蛇肽含量對抑制腫脹影響較大。

3.2 蛇肽保健酒對AA小鼠體質量的影響 與對照組相比較，模型組與陽性對照組小鼠體質量均有下降趨勢，且實驗過程中發現陽性對照組小鼠不活躍，毛色暗淡，可見地塞米松在治療關節炎的同時對機體也造成了一定的損傷，不良反應較大。

3.3 蛇肽保健酒對AA小鼠脾臟指數的影響 脾臟作為體內最大的淋巴器官，具有儲血、調節血量和參與免疫等重要功能。類風濕性關節炎病例的一個特征就是脾臟腫大［14］。蛇肽高、低劑量組小鼠脾臟腫大均顯著減輕，效果與地塞米松組相當。同時酒基對降低脾臟腫脹也有效果，且與蛇肽低、高劑量組結果相似。

3.4 蛇肽保健酒對AA小鼠CIC的影響 CIC是RA的一個重要檢測指標［9］。本研究發現：僅蛇肽低劑量組與陽性對照組小鼠CIC顯著降低，并恢復為正常水平。提示蛇肽酒與地塞米松均對調節AA小鼠體液免疫發揮作用。

綜合以上5個測量指標，低劑量蛇肽酒與地塞米松均對AA小鼠佐劑性關節炎具有顯著的治療效果，但低劑量蛇肽酒治療效果更好，且未見不良反應。蛇肽酒對佐劑性關節炎的最佳治療劑量及其他功效有待于進一步深入研究。

［1］余克強，羅仁.青藤堿對類風濕關節炎患者外周血單核源性樹突狀細胞趨化因子分泌和受體表達的影響［J］.南方醫科大學學報，2009，29（4）：635－637，641.

［2］劉彥虹，盧秀敏.類風濕關節炎自身抗體類風濕因子與抗瓜氨酸化蛋白抗體關系的研究進展［J］.國際檢驗醫學雜志，2011，32（9）：973－975.

［3］王勇，方勇飛，周新，等.青藤堿對佐劑性關節炎大鼠腹腔巨噬細胞表達細胞因子的影響［J］.中華風濕病學雜志，2003，7（7）：415－419.

［4］陳駿，李文勝，羅興菊，等.復方螞蟻酒對大鼠佐劑性關節炎的防治作用及其機制［J］.中國醫藥導報，2013，10（10）：12－13，16.

［5］劉岱岳，劉鵲華.蛇與蛇毒［N］.中國中醫藥報，2004－03－03.

［6］張春榮，余曉東，和七一，等.“蛇毒活性酒”功效的動物實驗研究［J］.檢驗醫學與臨床，2010，7（14）：1416－1418.

［7］孫曉迪，李銀清，趙雨，等.鹿筋膠原對大鼠佐劑性關節炎的治療作用［J］.中國中藥雜志，2009，34（23）：3135－3138.

［8］張黎明，陳志龍，趙杰，等.眼鏡蛇毒素抗類風濕性關節炎實驗研究［J］.藥學實踐雜志，2000，18（4）：209－211.

［9］楊曉軍.苗文麗.裴林.等.天星健骨方對佐劑性關節炎大鼠關節指數的影響［J］.中醫臨床研究，2012，4（2）：5－6.

［10］Goral J，Karavitis J，Kovacs EJ.Exposure－dependent effects of ethanol on the innate immune system［J］.Alcohol，2008，42（4）：237－247.

［11］Mendenhall CL，Theus SA，Roselle GA，et al.Biphasic in vivo immune function after low－versus high－dose alcohol consumption［J］.Alcohol，1997，14（3）：255－260.

［12］Romeo J，Warnberg J，Nova E，et al.Changes in the immune system after moderate beer consumption ［J］.Ann Nutr Metab，2007，51（4）：359－366.

［13］Romeo J，Warnberg J，Diaz LE，et al.Effects of moderate beer consumption on first－line immunity of healthy adults［J］.J Physiol Biochem，2007，63（2）：153－159.

［14］文浩平，和七一，鄧疆渝，等.五步蛇毒素對大鼠佐劑性關節炎的影響［J］.毒理學雜志，2010，24（4）：306－308.