重組人C反應蛋白在甲醇酵母中的分泌表達及鑒定＊

李軍明，林 衡，張立超，葛高順，胡學軍△

（大連大學：1.醫學院；2.生命科學與技術學院，遼寧大連 116622）

C反應蛋白（C－reactive protein，CRP）是目前發現的重要急性時相反應蛋白之一。其作為靈敏的炎癥指標、良好的心血管疾病發病診斷及其發病風險預測指標，對于許多疾病的篩查、監測以及療效評估具有重要價值［1－3］。目前商品化的CRP及其檢測試劑多依賴進口，價格昂貴，阻礙了其臨床研究與應用［4］。因此，本研究旨在探索利用真核甲醇酵母表達系統分泌表達并制備具有免疫反應性的重組人C－反應蛋白（recombinant human C－reactive protein，rhCRP），為進一步的rhCRP基礎研究及CRP檢測試劑的自主研制提供重要的實驗材料和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 限制性核酸內切酶、T4DNA連接酶購自大連TaKaRa公司；Zeocin抗生素、HisTrap HP純化柱、羊抗鼠IgG－HRP抗體均為Invitrogen公司產品；抗 His－Tag－HRP單克隆抗體、小鼠抗人 CRP單克隆抗體、3，3′，5，5′－四甲基聯苯胺（TMB）顯色液均購自Sigma公司，其它試劑為進口或國產分析純。

1.1.2 菌株和載體 畢赤酵母X－33、表達載體pPICZαA均為本實驗室保存，大腸桿菌（E.coli）JM109購自大連TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒pPICZαA／rhCRP的構建 參照GenBank中檢索到的編碼人CRP的基因序列及表達載體的多克隆位點的特點，設計rhCRP基因并委托GenScript公司進行人工合成后，經XhoⅠ、XbaⅠ雙酶切并插入到載體pPICZαA中后轉化至E.coli JM109；通過含Zeocin（25μg／mL）的LS－LB平板篩選陽性克隆，接種并提取重組質粒pPICZαA／rhCRP，然后進行雙酶切鑒定及測序鑒定。

1.2.2 重組質粒的酵母轉化及篩選 將SacⅠ線性化的pPICZαA／rhCRP及空載體pPICZαA各10μg，分別加入到80μL新制備的酵母感受態細胞中，通過電轉化的方式，將它們分別轉化入酵母 X－33中，于含Zeocin（100μg／mL）的 YPDS平板上、30℃溫箱中培養2～3d并將長出的單個菌落于含Zeocin（100μg／mL）的新鮮YPDS平板上再次篩選。

1.2.3 重組蛋白的誘導表達、純化及鑒定 將篩出的7個單克隆及陰性對照分別接種到含10mL BMGY培養基的50mL離心管中開始表達，方法參照Invitrogen公司提供的酵母表達手冊；經濃度為0.5%的甲醇誘導表達120h后，收集樣品并取上清進行 Western blotting鑒定分析。然后，進行搖瓶發酵。表達120h并收集全部上清后經0.02mol／L磷酸鹽緩沖液透析，用HisTrap HP柱純化rhCRP。采用SDS－PAGE、Western blotting及Gel DocTM EZ凝膠成像系統檢測分析表達純化產物。

1.2.4 重組蛋白的免疫反應性及穩定性鑒定 純化蛋白通過間接酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測其免疫反應性。將純化的rhCRP稀釋到適當濃度后，各取100μL稀釋液包被酶標板，同時做空白對照；采用1∶6000稀釋的鼠抗人CRP單克隆抗體作一抗，1∶5000稀釋的羊抗鼠IgG－HRP抗體作二抗；用TMB顯色后測定其吸光度值。將純化的rhCRP樣品保存于4℃冰箱4、8周后，分別重復上述的間接ELISA檢測。每次檢測各重復3次，取平均值進行比較分析。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，計量資料用表示，組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 重組質粒pPICZαA／rhCRP的構建 重組質粒pPICZαA／rhCRP經XhoⅠ、XbaⅠ雙酶切鑒定，可見約為681 bp的目的條帶和3491bp的載體條帶，片段大小與預期一致，見圖1；其測序結果經Vector NTI、Sequencher軟件分析顯示與設計的基因序列完全一致，表明重組表達載體構建正確。見圖1。

圖1 重組質粒pPICZαA／rhCRP的酶切鑒定

2.2 重組蛋白的誘導表達 篩選的7個單克隆酵母菌株，經0.5%的甲醇誘導表達120h后，取培養液上清進行Western blotting分析，結果顯示，其中3個單克隆在相對分子質質量約23×103處出現明顯特異性條帶，且大小與預期結果一致，而空載體酵母株未顯現出目的條帶，見圖2。

2.3 重組蛋白的分離純化及鑒定 純化的蛋白經SDS－PAGE檢測分析顯示，在相對分子質量為23×103處成功分離出單一的蛋白條帶，相對分子質量符合預期大小且蛋白的洗脫峰集中在2～7管的300mmol／L咪唑洗脫液中，見圖3；純化蛋白經Western blotting檢測證實為目的蛋白，見圖4；經Gel DocTM EZ凝膠成像系統檢測分析表明，一步純化即獲得純度達90.42%的rhCRP。

圖2 目的蛋白rhCRP的誘導表達

圖3 純化重組蛋白的SDS－PAGE分析

圖4 純化重組蛋白的Western blotting分析

圖5 重組蛋白的免疫反應性及穩定性鑒定分析

2.4 重組蛋白的免疫反應性及穩定性鑒定 經間接ELISA法將新制備的及于4℃保存4、8周后的rhCRP樣品進行其免疫反應性和穩定性的鑒定。結果顯示，其吸光度A450平均值分別為0.9621、0.9588和0.9589，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖5。

3 討 論

傳統獲得人CRP的方法主要是從患者血清或腹水中直接分離純化得到。由于人血清或腹水成分復雜，故純化時難度大、操作復雜，而且材料來源困難，產量低［4－5］。隨著生命科學的不斷發展，通過基因重組技術生產醫用蛋白是當今生物及醫學研究的熱點。目前，國內外利用基因工程的方法獲得重組人CRP的研究已有報道［6－9］，但都存在一定的弊端，本實驗在前人研究的基礎之上，進一步探究更經濟、更高效的制備rhCRP的途徑。

本研究選用了近年來發展非常迅速的一個真核表達系統－甲醇酵母表達系統，其表達外源蛋白具有眾多優勢［10］。酵母為簡單的單細胞真核生物，既具有原核細胞的生長快，可進行細胞高密度培養的特點，又具有類似真核細胞的翻譯后加工修飾功能［11］；既避免了大腸桿菌細胞［8］表達rhCRP時易形成包涵體、純化復雜等問題，又比哺乳動物細胞［7］和昆蟲細胞［6］生產rhCRP的成本低；而且該系統可分泌表達目的蛋白，易于目的蛋白的分離純化［10－11］。

本研究利用真核甲醇酵母表達系統，成功構建了rhCRP的畢赤甲醇酵母表達菌株，在強啟動子AOX1的調控下，成功分泌表達了rhCRP；經一步分離純化即分離出純度較高的rh－CRP，并經間接ELISA檢測證實其具有良好的免疫反應性和穩定性，為下一步rhCRP的優化表達研究、抗人CRP抗體制備以及人CRP檢測試劑的自主研發，提供了重要的實驗基礎。

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