PTEN survivin基因在肝癌組織中的蛋白表達及相關研究

王立成， 于淑玲， 于淑莉

(1.河北省承德市中心醫院普外科， 河北 承德 067000

2.河北省承德市第三醫院，河北 承德 067000

3.河北省承德市婦幼保健院， 河北 承德 067000)

本研究應用免疫組化的方法探討凋亡相關的兩個基因PTEN和survivin在HCC的表達情況與臨床病理學特征的關系及其相關性，以期探討評估HCC肝切除術后預后的相關指標，為肝癌的發生發展及治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 標本:肝癌標本43例均為承德市中心醫院2004年6月至2010年1月間手術切除標本，術前均未放化療，術后病理診斷為肝癌，切除肝癌標本常規制成蠟塊保存。癌旁組織取自癌灶旁2-3cm，經病理證實無癌細胞。臨床病理資料完整。男33例，女10例，年齡30-71歲，平均51±9.29歲;小肝癌(直徑≤5cm)16例，大肝癌(直徑＞5cm)27例;TNM臨床分期:Ⅰ期5例，Ⅱ期20例，Ⅲ期10例，Ⅳ期8例:組織學分級(Edmondson分級):Ⅰ級4例，Ⅱ級16例，Ⅲ級18例，Ⅳ級5例;術前血清AFP＞400g/L19例、侵襲轉移傾向高危組15例(15/43)，侵襲轉移傾向低危組28例(28/43)。血清AFP＞400μg/L 19例，＜400μg/L 24例。符合下列條件之一為侵襲轉移傾向高危組:肝門淋巴結癌轉移;門靜脈有癌栓;同一肝葉內主癌灶周圍腫瘤數目＞2個或有多個小衛星結節或伴有包膜侵襲破壞，無上述特征者為侵襲轉移傾向低危組。

1.2 試劑:小鼠抗人PTEN單克隆抗體、S-P法免疫組化檢測試劑 、DAB染色試劑盒(均購自北京中杉金橋生物技術有限公司)，鼠抗人survivin單克隆抗體(福州邁新生物技術有限公司)。

1.3 實驗方法:蠟塊均做4μm厚連續切片。免疫組化采用鏈霉菌-生物素(S-P)法，DAB顯色、蘇木素復染、脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。以0.01MPBS液(pH=7.5)替代一抗作為每次染色的陰性對照，已知表達的肝癌組織作為陽性對照。

1.3.1 PTEN結果判斷標準:PTEN蛋白陽性信號主要位于細胞胞漿內。PTEN蛋白在組織中的染色情況分3種:所有細胞均著棕色;部分細胞著棕色，部分細胞未著色(混合型染色);所有細胞均未著色。其中A，B歸為PTEN陽性表達組，C為PTEN陰性組。

1.3.2 survivin結果判斷標準:survivin蛋白表達主要位于胞漿或胞膜，按切片中腫瘤顯色深淺計分:A.細胞漿無顯色，0分(-)，B.細胞漿呈淡黃色石霧狀，1分(1+)，C.細胞漿呈黃色顆粒狀，2分(2+)，D.細胞漿呈均勻深黃色，3分(3+)。A、B為陰性，C、D為陽性表達。

1.4 統計學處理:應用SPSS12.0統計軟件處理。定性資料應用X2、spearman等級相關檢驗分析，P＜0.05存在顯著差異，P＜0.01有極顯著意義。

2 結果

2.1 PTEN蛋白的表達:43例HCC組織中PTEN蛋白表達陽性率48.8%(21/43)，陽性表達均位于HCC細胞漿(圖1-A)。癌旁組織中PTEN蛋白表達陽性率100%，癌組織與癌旁的表達差異顯著(P＜0.01)。PTEN蛋白的表達與HCC的組織分化程度(Edmondson病理分級)相關(r=0.477，P=0.026)，與血清AFP的濃度相關(r=-0.460，P=0.032)，與TNM分期、腫瘤侵襲性無關，見表1)。

表1 PTEN表達與HCC臨床病理特征的關系

2.2 survivin的表達:43例HCC中有30例陽性表達，表達率69.77%，(30/43)(圖1-G)大多數表達產物位于胞漿中(只有2例胞核弱表達)，癌旁肝組織中陽性率為25.58%(11/43)，癌組織的陽性率顯著高于癌旁肝組織，有顯著性差異(P＜0.01)，與血清AFP、腫瘤侵襲性和腫瘤細胞分化程度(Edmondson分級)有關(r=0.404，P=0.038;r=0.475，p=0.030;r=-0.490，P=0.021)，與TNM分期無相關，見表2。

表2 survivin的表達與HCC臨床病理特征的關系

2.3 PTEN與survivin之間的關系:分析本組43例HCC組織標本中PTEN，survivin基因的相關性(見表3)。經spearman相關分析發現PTEN與survivin的表達呈負相關(r=-0.471，P=0.031)，見表3。200)，B HCC 組織 Pten陰性表達(×200)，C PTEN 癌旁組織陽性(×100)，D HCC組織survivin陽性表達(×100)，E HCC 組織 survivin陰性表達(×200)，F HCC組織Survivin陽性表達(×40倍)。

表3 PTEN與survivin表達的關系

圖1 A PTEN在HCC組織中的陽性表達(×

3 討論

PTEN基因是具有雙重特性磷酸酶活性的抑癌基因，參與細胞生長調節和信號轉導，在腫瘤細胞浸潤、血管發生及腫瘤轉移中起到一定的作用。目前己在惡性膠質瘤、乳腺癌、子宮內膜癌等腫瘤中證實了這種基因的缺失和突變，PTEN雜合性缺失率為33%[1]。本組資料PTEN蛋白的陽性表達，癌組織為48.8%，癌旁組織為100%。資料顯示PTEN蛋白的表達與Edmondson病理分級相關:Edmonson分級Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級的陰性缺失率依次為20%，17.2%，54.2%和85.7%，表明HCC分化越差PTEN的缺失表達率越高，可能PTEN的缺失表達與HCC的進展有關。PTEN基因的表達與病人外周血AFP濃度和Edmondson病理分級相關，可能參與了HCC的發生發展，對腫瘤的診斷、治療和預后的判斷和評估可提供幫助。

Survivin基因是新近發現的一種凋亡抑制基因，具有抑制凋亡和調節細胞分裂雙重功能，一方面表達于胚胎和發育的胎兒組織，但不見于終末分化的成人組織;另一方面又廣泛表達于人類各種常見腫瘤組織，如肝癌、肺癌、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌等。本組 sur-vivin在癌組織中的表達率為69.77%，癌旁肝組織陽性率為25.58%，癌組織的陽性率顯著高于癌旁肝硬化組織和正常肝組織，與多數研究結果相近。Survivin的表達與腫瘤細胞分化程度即病理分級具有負相關趨勢[2]，本文結果亦顯示Survivin蛋白的表達與肝癌的病理分級有明顯相關，是肝癌分化差的標記，并與肝癌的AFP、侵襲性相關，與肝功能分級無明顯的相關性。我們認為survivin在HCC組織中呈高表達，促進了肝細胞的增殖和侵襲，可能參與肝臟組織惡變過程。說明該基因可能在肝癌的發生早期就產生影響，并且在癌腫的發展中起作用。

我們發現HCC的survivin陽性表達率越高，PTEN的陽性表達率越低，肝癌的分化越差，二者的陽性表達呈負相關，且均與HCC組織的病理分級、外周血中的AFP濃度相關;PTEN失表達的病例中，survivin蛋白大多表達陽性，提示組織中PTEN基因失活可能促使Survivin基因發生作用，可能機制為通過負向調節PI3K/AKt信號通路使Survivin下調，而PTEN的失活使得AKt活化，引起survivin上調，抑制腫瘤細胞的凋亡，共同參與腫瘤的形成機制，促進癌的發生發展及轉移?？梢哉J為兩者參與HCC發病機制的作用方式、作用點相似或相近，但作用方向和生物學效應相反[3]，有助于對HCC發病機制的進一步研究。它們的聯合檢測可能對惡性程度的判定，預后分析和進一步治療提供有效的依據。在子宮內膜癌[4]、結直腸癌中得到相同結論。

[1]Xiao，Wuh，Pandolfil，et al.A strocyte inactivation of the pRB pathway predisposes mice to malignant astrocytoma development that is accelerated by PTEN mutation[J].Cancer Cell，2002，1(2):157-168.

[2]Fields AS，Cotsonis G，Sexton D，et al.Survivin expression hepatocelluar carcinoma has correlation with proliferation prognostic parameters and outcome[J].Mod Pathol，2004，11:3356-3358.

[3]陶麗麗，陳莉.Survivin和PTEN蛋白在肝癌中表達關系探討[J].南通大學學報(醫學版)，2006，26(1):38-40.

[4]Pallares J，Martinez JI，Dolecet X，et al.Survivin expression in endometrial carcinoma:A tissue microarray study with correlation with PTEN and STAT-3[J].Int Gynecol Pathol，2005，24(3):247-253.