人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在膠原支架材料體外復(fù)合培養(yǎng)的生物學(xué)特性研究

王 琦， 劉宏利， 張中東， 虞攀峰， 初 冬

(中國(guó)人民解放軍空軍總醫(yī)院急診部， 北京 100036)

許多研究及本課題前期實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)，臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)條件下可以分別向骨、軟骨、脂肪組織分化，是組織工程良好的種子細(xì)胞。本研究在前期的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)膠原蛋白支架與MSCs具有很好的生物相容性，MSCs可以在膠原蛋白支架中逐漸貼附，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)入孔隙內(nèi)[1]，進(jìn)一步用免疫組織化學(xué)的方法觀察人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在膠原蛋白支架培養(yǎng)兩周后細(xì)胞特性變化，為作為組織工程復(fù)合體材料制備打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料:人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離自健康足月產(chǎn)婦臍帶，Ⅱ型膠原蛋白購(gòu)買自北京貝菱公司，是將18個(gè)月齡的健康牛跟腱通過(guò)酶解獲得，DMEM培養(yǎng)基采用市售產(chǎn)品，免疫組化ABC試劑盒購(gòu)買自DAKO A/S Denmark，CD 44、CD105、HLA-DR、Ⅰ型膠原抗體購(gòu)于中山公司。

1.2 方法

1.2.1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical MSCs，hU-MSCs)的培養(yǎng)細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定及體外分化實(shí)驗(yàn):將臍帶血管內(nèi)血液擠凈，再將包裹著血管的Wharton膠剪下、剪碎。將組織小塊收集于50mL離心管內(nèi)，反復(fù)清洗2-3次，清洗后的組織小塊種植于100 mm培養(yǎng)皿，加入含10%FBS的a-MEM培養(yǎng)基，在37℃、飽和濕度5%濃度的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔2日更換培養(yǎng)基，細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)更換新鮮培養(yǎng)液，次日胰酶消化傳代，計(jì)數(shù)后接種于新的培養(yǎng)瓶。取第4代生長(zhǎng)狀態(tài)良好細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。體外分化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行MSCs體外成骨和成脂肪能力鑒定。

1.2.2 支架與細(xì)胞共培養(yǎng):將膠原蛋白支架材料置入24孔培養(yǎng)板中，每孔各一塊，取消化后體外培養(yǎng)的第6代細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度2×106mL-1，每孔接種2mL，并浸沒支架，第二日更換培養(yǎng)液，每日使用相差顯微鏡觀察細(xì)胞與生物材料附著及生長(zhǎng)等情況。

1.2.3 組織學(xué)觀察:植入2周后，取出標(biāo)本，以10%中性福爾馬林固定，制備石臘切片，HE染色。

1.2.4 免疫組織化學(xué):切片脫蠟入水，緩沖液沖洗2次，0.3%-3%H2O2抗原修復(fù)，室溫，緩沖液3次;羊血清封閉30min，緩沖液3次，加入I抗4℃，濕盒過(guò)夜;室溫復(fù)溫1h，緩沖液3次，加入 II抗工作液，37℃、45min、濕盒;緩沖液3次，加入 III抗工作液，37℃，45min，濕盒;緩沖液3 次，;0.05M Tris-HCl(PH7.4)5min，室溫;DAB顯色，沖冼后置入蒸餾水，梯度酒精脫水，二甲苯透明，甘油明膠封片;對(duì)照組緩沖液代替一抗。

2 結(jié)果

2.1 hUC-MSCs細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定:接種后7-12d可見細(xì)胞從組織塊爬出，呈成纖維細(xì)胞樣，約2周時(shí)細(xì)胞達(dá)到80%匯合，可進(jìn)行傳代，生長(zhǎng)旺盛，流式分析表明，培養(yǎng)的 MSCs樣細(xì)胞表達(dá) CD29、CD44、CD73、CD105、CD166、HLA-A，B，C，(MHC-Ⅰ);不表達(dá) CD31(內(nèi)皮細(xì)胞抗原)、CD34(造血干細(xì)胞抗原)、CD45(白細(xì)胞共同抗原)、和HLA-DR(MHC-II)。細(xì)胞經(jīng)成骨和成脂誘導(dǎo)后高表達(dá)堿性磷酸酶活性及細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴，證明細(xì)胞具備成骨和成脂肪能力。

2.2 相差顯微鏡鏡下及組織化學(xué)結(jié)果:臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與支架共培養(yǎng)24h，細(xì)胞對(duì)支架材料有良好的趨向性，在倒置顯微鏡下在支架材料的邊緣明顯可見細(xì)胞長(zhǎng)入，大部分細(xì)胞呈梭形、多角形、不規(guī)則形等，黏附于膠原蛋白細(xì)胞支架上，HE染色顯示細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)呈棱形和多角形。膠原蛋白的多孔結(jié)構(gòu)非常有利于細(xì)胞長(zhǎng)入，在膠原蛋白纖維上有細(xì)胞密集區(qū)，細(xì)胞核呈橢圓形，染淡藍(lán)色，胞質(zhì)染淡紅色，具有良好的生長(zhǎng)形態(tài)，在細(xì)胞與纖維之間以及細(xì)胞與細(xì)胞之間均有較多突起相互交連，結(jié)果見圖1、圖2。

圖2 HE染色顯示細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)呈棱形和多角形

2.3 免疫組織化學(xué)觀察:免疫組織化學(xué)染色在光鏡下觀察陽(yáng)性信號(hào)為藍(lán)紫色，在光鏡下可清晰看到支架中的細(xì)胞呈樹突狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞胞漿成藍(lán)紫色，CD44、CD105、Ⅰ型膠原均表達(dá)陽(yáng)性。HLA-DR組未見胞漿呈藍(lán)紫色信號(hào)，HLA-DR表達(dá)陰性。陰性對(duì)照組織均未見到陽(yáng)性信號(hào)。結(jié)果見圖3-5。

圖3 CD44表達(dá)陽(yáng)性

圖4 CD105型抗體表達(dá)陽(yáng)性

圖5 Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性

3 討論

組織工程的重要作用是用于修復(fù)組織缺損，而單純細(xì)胞移植，由于缺乏附著點(diǎn)和空間結(jié)構(gòu)支持而呈漂浮狀態(tài)，也無(wú)良好的移植微環(huán)境，不利于細(xì)胞存活和發(fā)揮正常功能。因此在損傷部位橋接組織工程支架材料受到了廣泛關(guān)注，理想的載體材料應(yīng)該具有良好的組織相容性、生物降解性、生物活性等[2，3]。可作為移植治療的載體及移植后的生長(zhǎng)支架，對(duì)骨缺損起支撐填充作用，待細(xì)胞分化增殖填充后又可自行降解。常用細(xì)胞及生物材料復(fù)合移植有體內(nèi)直接植入法和體外復(fù)合細(xì)胞培養(yǎng)后再植入兩種[4]，體內(nèi)直接植入由于受多種體內(nèi)環(huán)境因素的影響，不能準(zhǔn)確觀察到生物材料與組織細(xì)胞的相容情況，而體外復(fù)合細(xì)胞培養(yǎng)可以直接觀察細(xì)胞與生物材料復(fù)合生長(zhǎng)的情況，較前者更為敏感、客觀[5，6]，是近年來(lái)研究生物材料相容性的主要方法。

臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞免疫表型與骨髓源性的MCS相似，體外誘導(dǎo)條件下可以分別向骨、軟骨、脂肪組織分化，在體內(nèi)具有成骨能力，可以為骨組織工程提供新的種子細(xì)胞來(lái)源。本實(shí)驗(yàn)選用膠原蛋白支架與MSCs在體外復(fù)合培養(yǎng)，觀察臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞在生物材料支架培養(yǎng)的免疫表型和成骨特性變化，膠原是動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富的蛋白，膠原不僅為細(xì)胞提供支持保護(hù)作用，而且與細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)、表型表達(dá)均有密切關(guān)系，可見膠原蛋白支架與MSCs具有很好的生物相容性。

進(jìn)一步免疫組織化學(xué)染色，在光鏡下可清晰看到支架中的細(xì)胞呈樹突狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞胞漿成藍(lán)紫色陽(yáng)性信號(hào)，CD44、CD105、Ⅰ型膠原表達(dá)陽(yáng)性，盡管不同學(xué)者檢測(cè)MSCs表面標(biāo)志物結(jié)果不盡相同，但一般認(rèn)為MSCs樣細(xì)胞表達(dá) CD29，CD44，CD73，CD105，CD166，HLA-A，B，C，(MHC-Ⅰ);不表達(dá) CD31(內(nèi)皮細(xì)胞抗原)，CD34(造血干細(xì)胞抗原)，CD45(白細(xì)胞共同抗原)，和HLA-DR(MHC-II)，但在支架上培養(yǎng)的hUCMSCs表達(dá) CD44、CD105、不表達(dá) HLA-DR，表明混合培養(yǎng)中不僅細(xì)胞與支架相容性良好，提示細(xì)胞在支架上培養(yǎng)仍保持了其干細(xì)胞的免疫表型。

[1]王琦，刁垠澤，馬慶軍.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其與膠原支架的相容性[J].組織工程與重建外科雜志，2009，5:1-3.

[2]Bruno S，Grange C，Deregibus MC，et al.Mesenchymal stemcell-derived microvesicles protect against acute tubular injury[J].Am Soc Nephrol，2009，20(5):1053-1067.

[3]Tetta C，BrunoS，F(xiàn)onsato V，et al.The role of microvesicles in tissue repair[J].Organogenesis，2011，7(2):105-115.

[4]Fansa H，Keilhoff G.Comparison of different biogenic matrices seeded with cultured Schwann cells for bridging peripheral nerve defects[J].Neurol Res，2004，26(2):167-173.

[5]王恒湘，郭子寬.間充質(zhì)干細(xì)胞在組織再生應(yīng)用中的諸多問(wèn)題[J].組織工程與重建外科雜志，2008，4:

[6]Neumann A，Reske T，Held M，et al.Comparative investigation of the biocompatibility of various silicon nitride ceramic qualities in vitro[J].Mater Sci Mater Med，2004，15(10):1135-1140.