硫酸軟骨素提取與純化方法研究

陳婷 嚴凌苓 成長玉

(1.江西生物科技職業學院動科系，江西南昌 330200 ;2.達州市食品藥品檢驗所，四川達州 635000)

硫酸軟骨素(chondroitin sulfate，簡稱CS)是來自動物軟骨組織的一類天然的酸性黏多糖(muc－opolysaccharide)——糖胺聚糖。研究發現，該物質主要是作為治療風濕和類風濕疾病的藥物。近年來，隨著對其生理功能和生化性質研究的深入，發現CS 具有抗凝、抗炎、抗血栓、抗癌及降低心肌耗氧量，促進冠狀動脈循環、降血脂、抗凝血和防止血管硬化等作用［1］。對冠心病、動脈粥樣硬化、心絞痛、心肌缺氧、心肌梗塞等心血管疾病的治療有一定療效;還對神經細胞、粘膜細胞、腎細胞等具有保護作用;CS 還可活化脂解酶，使脂肪降解，因此是防止肥胖有效物質;CS 可與某些物質調制成化妝品用于保護皮膚的健美;CS 還具有保水性、保膠性和高粘性，我國出口到日本、韓國的CS 都被用作食品添加劑。因此CS 是國內外流行的保健品和化妝品以及醫藥品的重要原料［2］。

1 硫酸軟骨素的概況

1.1 種類與分布

硫酸軟骨素是一種酸性粘多糖——糖胺聚糖，有多種異構體，它們均由D－葡萄糖醛酸、N－乙酰－D－氨基半乳糖硫酸脂為單位組成。只是硫酸基團的位置不同而有A、C、D和E 四種異構體。

硫酸軟骨素為結締組織的基本成分，與其他粘多糖共存，分布很廣。玻璃樣軟骨、頸韌帶、角膜、骨、軟骨肉腫、動脈、髓核、鞏膜、齒、人血清、尿、牛腦及脊髓、鹿茸及鹿角、長吻角鱉軟骨、烏賊皮中均含有。在軟骨中的含量占干燥量的20～40%。玻璃樣軟骨中也由于動物種、年齡、部位、疾病等不同，硫酸軟骨素的種類及量也不同。自然界中硫酸軟骨素多存在于動物軟骨、喉骨、鼻骨(豬含41%)、牛、馬中膈和氣管(含36%～39%)中，其他如腿骨、韌帶、皮膚、角膜等組織中也含有。魚類軟骨中含量很豐富，如鯊魚骨中含50%～60%，結締組織中含量很少。腔腸動物、海綿動物、原生動物也含有硫酸軟骨素。

1.2 化學結構

硫酸軟骨素是氨基己糖和葡萄糖醛酸交替連接而成的直鏈分子，通常含有50～70個雙糖單位，分子量為10000～50000D［3］。根據化學結構的不同硫酸軟骨素可分為硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素B、硫酸軟骨素C、硫酸軟骨素D和硫酸軟骨素E 等多種類型，如下圖所示［4］。

1.3 物理性質

硫酸軟骨素為白色、無臭、略帶咸味的固體粉末。由于其分子結構中帶有羥基、羧基、硫酸基等極性基團，故具有較強的吸濕性、易溶于水、難溶于甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、乙醚等多種有機溶劑。硫酸軟骨素的水溶液呈粘稠性，在強酸、強堿及高溫條件下易降解為分子量較小的低聚糖，導致溶液粘度下降［5］。

1.4 化學性質

多數硫酸軟骨素含有－SO3H和－COOH 等基團，是一種聚陰離子的高分子化合物，易與Na+、K+、Ca2+、Mg2+等陽離子結合［6，7］。

1.4.1 還原性

硫酸軟骨素含有半縮醛基，具有還原性，可將堿性酒石酸銅溶液中的Cu2+還原成紅色的氧化亞銅。

1.4.2 降解反應

硫酸軟骨素在中性低溫條件下較穩定，而在高溫強酸條件下易發生降解反應，使其分子量降低。硫酸軟骨素也可在硫酸軟骨素裂解酶ABC或硫酸軟骨素裂解酶B 等的作用下發生降解。

1.4.3 沉淀反應

硫酸軟骨素含有的硫酸基可與Ba2 +離子發生沉淀反應，沉淀物(BaSO4)在鹽酸或硝酸中均不溶解。

1.4.4 糖脎試驗

硫酸軟骨素可與苯肼在一定條件下發生反應生成糠脎［8］。

2 硫酸軟骨素的提取

硫酸軟骨素屬于酸性黏多糖，廣泛存在于動物的器官軟骨，目前酸性黏多糖的提取方法主要有降解法和非降解法.非降解法僅用于非蛋白多糖的黏多糖—透明質酸，而降解法適用于包括透明質酸在內的所有酸性黏多糖。硫酸軟骨素的提取采用降解法，降解法又包括堿提取法和蛋白酶提取法兩種。根據這些性質，硫酸軟骨素的提取方法有很多，歸納起來，主要有以下幾種［9］:

2.1 中性鹽法

先用l0%氯化鈣提取，氯仿－戊醇(1:4)除去蛋白質，2倍量乙醇沉淀，最后以Lloyd 試劑精制。而以透析法除雜質、氯化六氨合鈷純化，或一磷鎢酸純化，均可使工藝簡化。以30%氯化鉀或30%氯化鉀加1%碳酸鉀提取，高嶺土吸附除去雜蛋白，可提高產品收率。該方法提取的產品較白，各項指標符合國家標準，也不會造成環境污染，但是產率較低，造成原材料的大量浪費，對經濟效益有一定的影響。

2.2 堿提取法

2.2.1 濃堿提取法

將粉碎好的軟骨碎片稱重后，加入骨質量1.5倍的l5%氫氧化鈉溶液，室溫下進行浸提l2～16 h(分兩次進行)，然后用鹽酸調節pH 值到2.8～3.2，雙層紗布過濾30 min，留下濾液。將濾液調節pH 到8.5～9.0，按骨質量的4%加入胰蛋白酶，于50～54℃水解6 h，用鹽酸調節pH 到6.5，升高溫度到80～90℃，加入活性炭進行脫色反應，然后過濾，在濾液中加入1.5倍體積的無水乙醇進行沉淀分層4h，所得沉淀即為硫酸軟骨素，在60℃下干燥即得最終產品。

2.2.2 稀堿提取法

將粉碎好的軟骨碎片稱重后，加入骨質量6倍的2%氫氧化鈉溶液，60℃下進行浸提24 h(分兩次進行)，然后用鹽酸調節pH 值到2.5～3.0，雙層紗布過濾，留下濾液。將濾液調節pH 值到8.5～9.0，按骨質量的4%加入胰蛋白酶，于5O～54℃水解7 h，用鹽酸調節pH 到5～7，升高溫度到80～90℃，加入0.5%活性炭進行脫色反應，然后過濾，在濾液中加入1.5倍體積的無水乙醇和1.5%的氯化鈉溶液進行沉淀分層6h。所得沉淀再次加入1.5%的氯化鈉溶液和3倍體積的無水乙醇進行沉淀，所得即為硫酸軟骨素，然后在60～65℃下干燥即得最終產品。

2.3 堿鹽法

2.3.1 稀堿稀鹽提取法

將粉碎好的軟骨碎片稱重后，加入均為骨質量6倍的0.5%氫氧化鈉和2%的NaC1 混合溶液，室溫下進行浸提30 h(分兩次進行)，然后用鹽酸調節pH 值到8.5～9.0，加入骨質量4%的胰蛋白酶進行水解。水解后升溫到80～90℃，加入骨質量1.5%的滑石粉，過濾;加入1.7倍體積的無水乙醇進行沉淀，過濾后再加入1.5%的氯化鈉溶液進行沉淀過濾;加入1.7倍體積的無水乙醇再次進行沉淀過濾，所得沉淀物于60℃下干燥即得最終產品。

2.3.2 稀堿濃鹽提取法

將粉碎好的軟骨碎片稱重后，加入骨質量5倍的0.4%氫氧化鈉和20%的氯化鈉混合溶液(pH 值為13)，室溫下進行浸提30h(分兩次進行);用鹽酸調節pH 值到7.8，升溫到80～90℃，加入骨質量4%的滑石粉，將鹽解液調節pH 值到2～3，過濾1h;將濾液加入1.5倍體積的水進行稀釋，同時調節pH 值到6.5;加入1.7倍體積的無水乙醇沉淀12h，將沉淀物加入1.5%的氯化鈉溶液進行沉淀過濾;加入1.7倍體積的無水乙醇再次沉淀8h，所得沉淀物于60℃下干燥即得最終產品。

2.4 酶提取法

2.4.1 稀堿——酶解提取法

鄒開朗［10］等提出稀堿與酶解相結合法生產硫酸軟骨素。先將軟骨在80℃水中煮4－6 h，然后按原料(干質量)與2%氫氧化鈉的比例為1:6.25的量加入氫氧化鈉溶液，室溫提取1.5 h，然后用鹽酸調pH 值到6.0－6.5，雙層紗布過濾:留下濾液，濾渣再以1:0.12的質量比加入2%的氫氧化鈉溶液，于40℃下提取lh，再用雙層濾布過濾;棄濾渣，取濾液。合并2次濾液，并測量體積待用。濾液調節pH 值到8.0～9.0，按濾液與胰酶1000:0.5的比例加入胰酶，于40～50℃水解lh 后，再按1000:0.5的質量比加入胃蛋白酶，40～50℃水解1.5h，過濾后加入高嶺土和活性炭附。用氯仿反萃取法萃取濾液，留水層。調水層pH 值至6.8～7.2，再加入2.5倍體積的95%以上乙醇沉淀，即得硫酸軟骨素。

2.4.2 復合酶酶解提取法

王鳳琴［11］等用復合酶解法提取硫酸軟骨素。把豬肋、喉、氣管等軟骨預處理后，以骨粉1:3的比例加入去離子水，加入原料量1%的復合酶，于55℃攪拌酶12～15 h。復合酶水解液用鹽酸調pH 值7.5，加入2%的醋酸鈉溶液，攪拌溶解后，升溫到85℃，保溫20min，過濾去殘渣，濾液加入胰酶酶解。經酶解后的酶解液在85℃下維持15min，過濾，乙醇沉淀，干燥磨粉后得成品。影響該工藝水解反應的因素為酶解溫度、pH 值與加酶量，利用正交試驗得出優化條件為溫度50℃、pH值8.6～8.9、加酶量0～39L，收率達17.84%。采用全新的雙酶酶解工藝和中空纖維超濾等現代技術生產硫酸軟骨素，由于酶作用專一性強的特點，質量穩定、收率高，產品顏色潔白，生產周期較短。

2.4.3 酶解－樹脂提取法

將軟骨絞碎，加1 mol/L的氫氧化鈉溶液浸泡，40℃保溫水解2 h 或加pH 值為7.5的水浸泡，用蛋白酶55℃保溫水解20 h，再加鹽酸中和至近中性，過濾;調整濾液中NaCI 濃度達到0.5 moI/L后，將溶液通過Amberlite IRA－933 離子交換樹脂柱吸附完畢;用0.5 mol/L的NaCI 液洗滌，再用1.8moI/L的氯化鈉液洗脫，流速2 L/h，洗脫液脫鹽，乙醇沉淀，離心分離，收集沉淀，真空干燥，即得成品。應用此工藝制得的硫酸軟骨素樣品，經紙電泳檢查為單一區帶，抗原物質試驗結果為陰性，含硫量為7.2%。其優點是酶水解或稀堿水解與樹脂交換技術相結合，保證了硫酸軟骨素分子不降解，解決了成品純度的問題。該方法簡便，收率高，是一種較有實用價值的制備方法［12］。

2.5 超聲輔助法

超聲輔助法是利用超聲波的空化作用，使物料周圍形成空穴，從而有利于硫酸軟骨素提取的方法。采用超聲輔助的堿提酶解法提取硫酸軟骨素，其提取物中硫酸軟骨素的含量和得率并無明顯提高，但可大大縮短提取時間。

蒲志軍［13］等利用超聲波法制備硫酸軟骨素，其原理是在堿性條件下蛋白質易離解和超聲波的熱學機制促使蛋白質快速解離而達到去雜蛋白的目的，然后升溫(85～90℃)均能使解離的蛋白質變性吸附到白陶土上，從而使硫酸軟骨素與蛋白質分離，提高產品質量。

2.6 乙酸抽提法

Nakand［14］等利用乙酸水溶液提取硫酸軟骨素。先把鮮軟骨上的脂肪、肉及其他軟組織去掉，在－20℃冷凍，使用前在4℃解凍，把軟骨放在水中，用乙酸調節pH 值為4.5，在37℃下抽提7 h。抽提液沸騰濃縮后，在90℃下干燥即得硫酸軟骨素粗品，影響硫酸軟骨素浸出率的主要影響因素是pH 值。該工藝流程簡單，成本較低，可以考慮商業化大規模生產。但是目前在國內還沒有廠家用這種工藝生產硫酸軟骨素。

3 硫酸軟骨素的純化

3.1 溶劑法

溶劑法是利用軟骨中不同化學成分的溶解性差異，而將硫酸軟骨素與其它雜質相互分離的純化方法［15］。硫酸軟骨素含有的硫酸基、羧基和羥基等親水性基團，使其易溶于水，不溶于乙醇、甲醇、丙醇和丙酮等有機溶劑。一定條件下，采用乙醇沉淀法可得到純度為70%～78%的硫酸軟骨素。將較低純度的硫酸軟骨素溶于濃度為2%(w/v)的NaCl 溶液中，加入定量乙醇，于低溫下靜置后離心，重復以上步驟可依次得到較高純度的硫酸軟骨素。采用甲醇和丙醇也可得到同樣的效果。

3.2 季銨鹽沉淀法

溶液中以聚陰離子形式存在的硫酸軟骨素可與季銨鹽類化合物(如溴化十六烷基三甲銨或氯化十六烷基吡啶等)形成水溶性很小的季銨鹽絡合物。這些絡合物在低離子強度的水溶液中不溶解，當其增大到臨界離子強度時，可發生解離并溶解，利用該性質可使硫酸軟骨素得到分離純化。季銨鹽類化合物沉淀法一般需要控制硫酸軟骨素的濃度為0.1%～1.0%(w/v)范圍內，硫酸軟骨素與季銨鹽發生化學反應的質量比為1:3，沉淀后季銨鹽的最終濃度應大于0.05%(w/v)［16］。

3.3 超濾膜法

超濾膜法是利用濾膜孔徑的不同使硫酸軟骨素與其它非多糖類雜質分離，而得到分子量分布范圍較窄且純度較高的硫酸軟骨素的方法。采用管形的三氧化二鋁膜純化硫酸軟骨素，其濾膜的孔徑分別為100nm、50nm、20nm，溶液的透過速度分別為90 L·h－1·m－2、60 L·h－1·m－2、43L·h－1·m－2，硫酸軟骨素的截流率均可達到100%，雜質透過率分別為50%、65%、70%。

3.4 色譜法

溶液中的硫酸軟骨素以聚陰離子的形式存在，采用陰離子交換劑通過交換吸附可對其進行純化。離子交換色譜法是依靠庫侖力的作用將物質吸附在交換劑上，然后選擇合適的溶液進行洗脫，達到其純化的目的［17］。采用Dowex－X2型強堿型陰離子交換樹脂，梯度洗脫體系為硼酸－氯化鈉溶液，流速為2.0mL·min－1，柱溫55℃，壓力為1.5～3.4kg·cm－2。當氯化鈉溶液濃度為1.5mol·L－1時，可得到純度較高的硫酸軟骨素，回收率為85%。

3.5 電泳法

根據化合物所帶電荷類型和數量的不同，采用電泳法可將硫酸軟骨素與其它雜質分離開。電泳法具有分辨率、目標物純度和回收率均較高的特點。采用雙相電泳法純化硫酸軟骨素時，第一相電泳條件為pH 值6.0的吡啶/醋酸/水(10∶ 1∶ 89，v/v)緩沖液，電場強度為7.5V·cm－1，電泳時間為60min;第二相電泳條件為pH 值7.7 醋酸鋇緩沖液，電場強度為7.5V·cm－1，電泳時間為130min，可得到純度為82%(w/w)的硫酸軟骨素。采用瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為0.05mol·L－1的1，2－二氨基丙烷緩沖液(pH9.0)，電流強度為50mA，電泳時間為80min，可得到純度為90%(w/w)的硫酸軟骨素，但其回收率僅為45%［18］。

4 展望

目前對CS的工藝研究大多是對現有方法的優化，今后的研究仍會以減少提取劑用量、提高收率與產品純度為目標，并逐漸將研究成果應用于實際生產中。在結構分析方面，則要優化現有方法，加強對不同來源CS 及其衍生物結構的認識，并注重將活性與結構研究相結合。

CS 是重要的生化藥物，因其特有的生物活性而廣泛用于臨床。未來的研究應在加強生產工藝、分析技術和活性研究的基礎上開發新的CS 資源，重視擴展其在功能食品、保健品等領域的應用。

［1］肖凱軍，等.鯊魚軟骨粘多糖的提取［J］.化工學報，2001，52(8):2761.

［2］吳立芳，馬美湖.我國畜禽骨骼綜合利用的研究進展［J］.現代食品科技，2005，21(1).

［3］施文健，吳程華，莊奇佳.十六烷基三甲基溴化銨光度滴定法測定硫酸軟骨素鈉鹽［M］.理化檢驗－化學分冊，2003，39(3):147－150.

［4］Kazuyuki Sugahara，Satoml Nadanaka，Kyoko Takeda.Structural analysis of unsaturated hexasaccharides isolated from shark cartilage chondroitin sulfate D that are substrates for the exolytic action of chondroitin sulfate ABC lyase.Europe of journal biochemistry，1996，239:871－880.

［5］朱瑞芬，童興龍，李穎.硫酸軟骨素的研制［J］.中國醫藥工業雜志，2000，31(6):255－256.

［6］羅曼，蔣立科.硫酸軟骨素快速提取法研究［J］.動物學雜志，2000，35(5):37－40.

［7］余仲建.現代有機分析［M］.天津:天津科技出版社，1994:202－205.

［8］張啟峰.有機分析教程［M］.北京:中國標準出版社，1996:198－201.

［9］陳紅麗，楊永鋒等.硫酸軟骨素提取方法研究［J］.河南科學，2008，9(26):1039－1041.

［10］鄒開朗，鄒國林.硫酸軟骨素快速提取法研究［J］.氨基酸和生物資源，2000，22(3):22.

［11］王鳳琴.硫酸軟骨素生產新工藝的研究［J］.淮陰工學院學報，2003，12(3):7.

［12］李良鑄，李明嘩.最新生化藥物制備技術［M］.北京:中國醫藥科技出版社，2001.

［13］蒲志軍，馬林，嘉慶等.超聲波法制備硫酸軟骨素生產工藝的研究［D］.四川師范大學學報:自然科學版，2000，23(6):640.

［14］Nakano T，Lkawa N，Ozimek L.An economical method to extract chondroitin sulphate－peptide from bovine nasalcartilage［J］.Canadian Agricultural Engineering，2000，42(4):205.

［15］Nicola Volpi.Purification of heparin，dermatan sulfate and chondroitin sulfate from mixtures by sequential precipitation with various organic solvents.Journal of chromatography B，1996，685:27－34.

［16］Nicola Volpi，Milena Dondi，Anna Maria，et al.Characterization of a small chondroitin sulfate proteoglycan isolated from the mucus surrounding the embryos of Vivi parusater.Biochimica et biophysica acta，1998，1380:239－248.

［17］陳健，郭祀遠，李琳，等.聲電場強化超濾鯊魚鰭軟骨粘多糖［J］.華南理工大學學報(自然科學版)，2003，2:9－10.

［18］Hirofumi Inoue，Ryoichi Nakayama，Kaoru Otsu，et al.Release of inorganic ion under mild alkaline condition from sulfate，unsaturated disaccharides obtained from chondroitin sulfates by chondroitinase digestion.Carbohydrate research，1986，155:277－282.