HPLC 法測定蘋果樹腐爛病菌發(fā)酵液中的有機酸和葡萄糖*

簡利茹，王海瑛，韓青梅

1(旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室(西北農(nóng)林科技大學(xué))，陜西 楊凌，712100)2(西北農(nóng)林科技大學(xué)植保學(xué)院，陜西 楊凌，712100)

蘋果樹腐爛病是由蘋果黑腐皮殼菌(Valsa mali Mayabe et Yamada)引起的一種蘋果樹枝干病害［1-2］，在我國各蘋果產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，可以使蘋果樹主枝、主干枯死，給蘋果產(chǎn)業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失［3-5］。王建華等［6］報道，蘋果樹腐爛病菌發(fā)酵液中有機酸對根皮苷的降解有很大影響，所以研究發(fā)酵過程中有機酸的生成量及葡萄糖的消耗速率，對于確定菌體內(nèi)的代謝通量分布及發(fā)酵過程的優(yōu)化控制都具有重要意義。

近年來，有機酸和葡萄糖的檢測方法多用高效液相色譜法(HPLC)，如胡志群等［7］用高效液相色譜測定荔枝果肉的酸和糖是用不同的柱子分開檢測，此法分析時間長，流動相損耗大，易污染。姜岷等［8］利用Aminex HPX-87H 離子排斥色譜柱測定纖維素水解液厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸發(fā)酵液中有機酸和混合單糖，由于氫離子交換柱較貴，一般實驗室不具備此柱子。白冬梅等［9］利用Eclipse XDB-C8柱同時檢測琥珀酸發(fā)酵液中的有機酸和葡萄糖，圖譜分離效果不好，拖尾嚴重。因此，對蘋果樹腐爛病菌等微生物發(fā)酵液這種培養(yǎng)基組分復(fù)雜而待測物含量較低的樣品，一種高靈敏度快速測定的方法顯得尤為重要。本研究應(yīng)用C18柱，采用HPLC 法串聯(lián)兩種檢測器進行檢測，建立了一種能夠快速準確測定蘋果樹腐爛病菌發(fā)酵液中有機酸和葡萄糖的方法。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

試劑:蘋果酸(色譜純)、乳酸(色譜純)、檸檬酸(色譜純)、富馬酸(色譜純)、琥珀酸(色譜純)及葡萄糖(色譜純)均購自SIGMA 公司。甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，實驗用水為Milli-Q 二次超純水。蘋果樹腐爛病菌由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物病害綜合防治實驗室提供。

儀器:Waters 600 型高效液相色譜儀，美國Waters 公司;PB-10 型酸度計，德國Sartorius 公司;Mill-Q水處理系統(tǒng)，MILLPORE 美國公司。

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)液成分(g/L):葡萄糖10，L-天門冬酰胺2，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，ZnSO4·7H2O 0.88，F(xiàn)e(NO3)3·H2O 0.0015，MnSO4·5H2O 0.000 44，去離子水1L。

1.3 發(fā)酵液的制備

在200 mL 滅菌液體培養(yǎng)基中，加入7 塊直徑7 mm 的蘋果樹腐爛病菌菌餅，25℃下靜置培養(yǎng)，每天振搖2 次。定期取1 mL 發(fā)酵液于10 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm 針式水膜過濾后進樣10 μL 進行高效液相檢測。

1.4 混合標準溶液的配制

精確稱取蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸各100 mg、富馬酸2 mg 和葡萄糖6 g，用二次水溶解并定容于100 mL 容量瓶中，配置成標準混合溶液，其中富馬酸0.02 mg/mL、葡萄糖60 mg/mL，其他組分1 mg/mL，再用二次水將標準溶液分別稀釋2 倍、10 倍、50倍、100 倍、200 倍及1 000 倍。

1.5 色譜條件

采用Waters600 型高效液相色譜儀(美國Waters公司)，以5 g/L NH4H2PO4(用磷酸調(diào)pH=2.5)溶液為流動相;分析柱為Atlantis C18色譜柱(150 mm ×4.6 mm，3.5 μm);流速0.6 mL/min;柱溫30℃;Waters 2487 紫外檢測器，檢測波長210 nm;Waters 2414示差檢測器，檢測器溫度40℃;上樣量為10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC 實驗方法的建立

2.1.1 色譜柱的選擇

有機酸常采用C18硅膠柱進行分離，因有機酸極性較大，使用的流動相中水的比例較高，一般色譜柱在高水相環(huán)境中容易疏水塌陷，因此實驗中選用了更耐水相的Waters 公司的Atlantis C18色譜柱。

2.1.2 柱溫的選擇

設(shè)定柱溫20℃、30℃、38℃對標準溶液中各組分進行分離。由于溫度升高時會增加有機酸的離解，各有機酸分離效果不好;但溫度降低組分的響應(yīng)值減小，保留時間增加，分析時間延長。比較不同溫度下的分離曲線圖譜，選擇最佳分離溫度為30℃。

2.1.3 檢測器的選擇

利用有機酸及葡萄糖對紫外檢測器及示差檢測器響應(yīng)信號強弱的差異，同時經(jīng)過Atlantis C18色譜柱有效的分離，洗脫樣品先經(jīng)紫外檢測器檢測其中的有機酸，再經(jīng)示差檢測器檢測葡萄糖。示差檢測器溫度設(shè)定為恒定40℃。

2.1.4 流動相pH 值的選擇

有機酸為弱酸性，在流動相水的比例較大的環(huán)境中易被電離。流動相合適的pH 值會改善峰形對稱，減少峰拖尾。通過了解有機酸的解離常數(shù)［10］，本實驗考查了流動相的pH 值在2 ～3 對分離的影響，結(jié)果表明，pH 值越小峰型越好，考慮到C18柱對酸的耐受性，本實驗最終選用流動相的pH 為2.5。

2.1.5 流動相緩沖鹽濃度的選擇

分別配成濃度為2 g/L、5 g/L、8 g/L、10 g/L 的NH4H2PO4溶液(用磷酸調(diào)pH 為2.5)對標準溶液進行分析以考察緩沖鹽濃度對色譜分離的影響。結(jié)果表明:當緩沖鹽濃度大于5g/L 時，各組分都得到有效分離。由于緩沖鹽濃度越大對泵和色譜柱的壽命都會產(chǎn)生影響，所以最終選用5 g/L 的NH4H2PO4作為流動相。

2.2 標準曲線和線性范圍的測定

取各系列混合標準溶液10 μL，在最佳色譜條件下上機進行分析，混合標樣(富馬酸0.4 μg/mL，葡萄糖1.2 mg/mL，其他有機酸20 μg/mL)的紫外(UV)和示差(RI)色譜圖如圖1。從圖1 可以看出，在210 nm 下，除葡萄糖外，其他有機酸都能被很好地分離并被紫外檢測器檢測出;而示差檢測器對富馬酸沒有響應(yīng)，雖其他有機酸能夠和葡萄糖很好的分離但響應(yīng)較低。最終確定以紫外檢測器分析有機酸，以示差檢測器分析葡萄糖，各組份的峰面積y 對濃度x 進行線性回歸，得到各物質(zhì)的線性回歸方程。線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限(信噪比為3)等定量參數(shù)見表1 。

圖1 混合標準溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of standards mixtures

表1 標準曲線的線性參數(shù)Table1 The linear parameters of standard curves

2.3 發(fā)酵液樣品的測定

取蘋果樹腐爛病菌搖瓶發(fā)酵不同時間(0、1、2、4、6 d)的發(fā)酵液，在上述分離條件下進行色譜分析，測定其葡萄糖的消耗和產(chǎn)生的有機酸，結(jié)果見表2，圖2 為發(fā)酵2d 的色譜分離圖。

表2 不同發(fā)酵時間的測定結(jié)果Table 2 The determination results of different fermentation time

從圖2 可知，蘋果樹腐爛病菌發(fā)酵產(chǎn)物比較復(fù)雜，除了產(chǎn)生一些有機酸外，還有其他一些未知物。從表2 可以看出隨著發(fā)酵時間的延長，有機酸的產(chǎn)量都呈上升趨勢，而葡萄糖經(jīng)過6d 發(fā)酵后幾乎消耗殆盡。

2.4 方法的回收率和重復(fù)性試驗

取同一發(fā)酵液4 份，其中一份作本底，按上述實驗方法重復(fù)測定5 次，考察方法精密度;另3 份各添加一定量的標準物質(zhì)，考察回收率，結(jié)果見表3。本方法的回收率為96.2% ～102.2%，精密度為0.26%～0.75%，且不受發(fā)酵液中大量雜質(zhì)的干擾。

圖2 蘋果樹腐爛病菌發(fā)酵液色譜圖Fig.2 Chromatogram of Valsa mali Var. mali fermentation liquid

表3 回收率和精密度實驗結(jié)果(n=5)Table 3 Results of recovery and precision (n=5)

3 結(jié)論

蘋果樹腐爛病菌發(fā)酵液經(jīng)過離心處理后，采用反相Atlantis C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)，以5 g/L NH4H2PO4溶液(pH2.5)為流動相，流速0.6 mL/min，柱溫30℃，采用不同的檢測器，可同時分析待測樣中的有機酸及葡萄糖，每一樣品的分析過程不超過15min。此方法快速、高效、準確，可用于在線監(jiān)測發(fā)酵過程中底物的利用情況及產(chǎn)物生成情況，確定菌體內(nèi)的代謝通量分布，從而對發(fā)酵過程的優(yōu)化控制具有重要的意義。

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