發酵過程流加L-谷氨酸提高ε-聚賴氨酸的產量*

董難，陳旭升，任喜東，曾昕，孫啟星，張建華，毛忠貴

(江南大學生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)具有抑菌譜廣、耐熱性強、水溶性好和安全性高等特點，被認為是取代現行化學食品防腐劑的理想選擇，已在日本、韓國和美國等國家得到廣泛應用。同時，它還被廣泛用于生物可降解材料、乳化劑、高吸收性水凝膠、藥物載體、抗癌增進劑和生物芯片外被等領域的應用研究［1］。因此，ε-PL 是一種附加值高、應用范圍廣和市場潛力大的新興生物技術產品。

當前，微生物發酵法是ε-PL 生產的唯一方式。盡管國際上最高ε-PL 發酵水平已經達到48.3 g/L［2］，但國內發酵水平普遍處于25 g/L 左右［3-5］。限制國內ε-PL 發酵水平的關鍵在于產生菌的ε-PL 合成速率低下。大量研究結果表明，篩選ε-PL 合成前體L-賴氨酸結構類似物(S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸)抗性突變菌株是提高產生菌ε-PL 合成能力最有效方法之一［6-9］。然而，僅僅解除天門冬氨酸激酶的反饋抑制以增強L-賴氨酸合成能力，而不增加其上游三羧酸循環碳代謝流和相匹配的氮骨架供應能力，依然不能充分發揮ε-PL 高產突變株潛力。目前，還未見基于強化三羧酸循環和氮骨架供應而提出的菌株改造或發酵工藝優化策略的報道。Takehara 等指出L-谷氨酸通過轉氨作用為L-賴氨酸合成過程提供氮骨架，同時生成的α-酮戊二酸會進入三羧酸循環［10］。因此，本研究利用1 株ε-PL 高產菌Streptomyces sp.M-Z18 考察外源流加L-谷氨酸對其菌體生長和ε-PL合成的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株

Streptomyces sp. M-Z18 由工業生物技術教育部重點實驗室人員從土壤中篩選，經紫外線和亞硝基胍誘變后，篩選S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸抗性而獲得的1 株ε-PL 高產突變株。

1.2 培養方法

種子培養和搖瓶發酵按照文獻［11］進行。

分批發酵和補料-分批發酵按照文獻［12］進行，并作如下調整:發酵起始pH6.8 下降至3.8 時，用10% ～14%的氨水或2 mol/L H2SO4維持恒定直至發酵結束。添加L-谷氨酸以高濃懸浮液形式加入到發酵罐中。

1.3 分析方法

菌體干重(DCW)、甘油和ε-PL 含量測定均按文獻［12］進行。

L-谷氨酸測定:利用SBA-40D 生物傳感分析儀(山東省科學院生物研究所)測定。進樣量:25 μL。

2. 結果與分析

2.1 搖瓶發酵過程中L-谷氨酸添加濃度對ε-PL 合成和菌體生長的影響

當搖瓶發酵至18 h(ε-PL 開始合成)，開始添加L-谷氨酸，使得搖瓶中L-谷氨酸濃度分別控制在0、5、10、15 和20 g/L 水平。96 h 發酵結束后，ε-PL 產量和菌體量如圖1 所示。

圖1 搖瓶發酵中L-谷氨酸濃度對Streptomyces sp.M-Z18 菌體生長和ε-PL 合成的影響Fig.1 Effect of L-glutamate acid on cell growth and ε-PL production by Streptomyces sp. M-Z18 in shake-flask fermentation

從圖1 可以看出，ε-PL 產量和菌體量隨L-谷氨酸添加濃度的增加而提高。在添加20 g/L L-谷氨酸時，ε-PL 產量和菌體量分別達到3.82 g/L 和10.84 g/L，較未添加L-谷氨酸發酵提高了82.3% 和58.9%。這說明在發酵過程中添加L-谷氨酸不僅能夠促進Streptomyces sp. M-Z18 菌體的生長，還能促進ε-PL 的合成。然而，由于L-谷氨酸在ε-PL 發酵條件(30℃，pH3.8)下溶解度只有10.4 g/L［13］，所以在添加20 g/L L-谷氨酸時出現了部分L-谷氨酸未溶解現象。故將下述5 L 發酵罐中L-谷氨酸添加濃度設定在15 g/L。

2.2 發酵罐分批發酵中L-谷氨酸添加時機對ε-PL合成的影響

為了考察L-谷氨酸添加時機對ε-PL 合成過程的影響，分別選擇在ε-PL 合成起始階段(14 h)和高峰階段(36 h)添加15 g/L L-谷氨酸，實驗結果如圖2B和圖2C 所示。從發酵時間上看，不管是ε-PL 合成起始階段還是高峰階段添加L-谷氨酸，均比未添加L-谷氨酸(圖2A)的發酵時間縮短5 h，從而使得甘油平均消耗速率提高了10.5%。從ε-PL 產量上看，在ε-PL 合成起始階段和高峰階段添加L-谷氨酸的ε-PL產量分別為7.86 g/L 和7.53 g/L，較未添加L-谷氨酸發酵(6.59 g/L)提高19.3% 和14.3%。ε-PL 合成起始階段添加L-谷氨酸時，ε-PL 的產率為4.01 g/(L·d);高峰階段添加L-谷氨酸ε-PL 的產率為3.84 g/(L·d)，較未添加L-谷氨酸的產率2.97 g/(L·d)分別提高35%和29.3%。另外，前期添加L-谷氨酸和高峰期添加L-谷氨酸的DCW 分別為21.63 g/L 和21.05 g/L，與未添加L-谷氨酸的15.75 g/L 相比，也分別提高37.0%和33.6%。上述實驗結果表明，添加L-谷氨酸可以在一定程度上促進碳源的消耗、ε-PL的合成和菌體的生長。但不同時間添加谷氨酸對菌體的生長和ε-PL 的合成影響較小。

從圖2B 和圖2C 可以看出，不管是ε-PL 合成前期還是高峰期添加L-谷氨酸，15 g/L L-谷氨酸大約在11 h 就會被消耗完。為了保證在分批發酵過程中始終有L-谷氨酸被利用，待ε-PL 合成前期培養基中添加的L-谷氨酸消耗完后，重新添加15 g/L L-谷氨酸，重復此過程直至發酵結束，實驗結果如圖2D 所示。分批發酵過程中流加L-谷氨酸，使得分批發酵時間延長至56.5 h，比未添加L-谷氨酸發酵時間延長4.5 h;甘油消耗速率［25.5 g/(L·d)］比未添加L-谷氨酸時甘油消耗速率［27.7g/(L·d)］也有所下降。但這和添加谷氨酸可以促進碳源消耗是不矛盾的。谷氨酸也可以作為碳源被細胞利用，在流加谷氨酸的試驗中谷氨酸共添加45 g/L，谷氨酸的消耗速率可計算得到為19.1 g/(L·d)。因此，雖然流加谷氨酸導致甘油的消耗速率降低了，但是總的碳源消耗速率卻提高了。值得一提的是，ε-PL 產量和產率分別為11.01 g/L 和4.68 g/(L·d)，與未添加L-谷氨酸相比分別提高了67.1%和57.5%;DCW 為25.67 g/L，比未添加L-谷氨酸相比提高了63.0%。上述實驗結果表明，分批發酵過程中連續多次流加L-谷氨酸相比于一次添加更有利于菌體的生長和ε-PL 的合成。

2.3 補料-分批發酵中流加谷氨酸對ε-PL 合成的影響

補料-分批發酵是大量生產ε-PL 的有效方法。為了獲得更高的ε-PL 產量和產率，將上述建立的連續流加L-谷氨酸方式與補料- 分批發酵方法相結合，實驗結果如圖3A 所示。經過連續174 h 補料-分批發酵和8 次L-谷氨酸流加，最終實現ε-PL 產量和產率分別達到31.65 g/L 和4.36 g/(L·d)，與未添加L-谷氨酸的補料-分批發酵ε-PL 產量(21.22 g/L)和產率［3.03 g/(L·d)］相比(圖3B)，分別提高49.2%和43.9%。由此可見，在補料-分批發酵過程中流加L-谷氨酸是實現高產量、高產量和高生產強度ε-PL 發酵的有效方式。

另外，流加L-谷氨酸的補料-分批發酵DCW 為37.7 g/L，與未添加L-谷氨酸的補料- 分批發酵的38.04 g/L 相當。雖然流加L-谷氨酸的補料-分批發酵的DCW 并未大于未添加L-谷氨酸補料-分批發酵的DCW，但從圖3 中可以看出，流加谷氨酸補料-分批發酵前期的菌體生長速率要大于未添加谷氨酸補料-分批發酵前期的菌體生長速率。因此，流加谷氨酸的補料分批發酵更早達到菌體生長穩定期。到達菌體生長穩定期后，谷氨酸對菌體生長的促進效果沒有在對數期那樣明顯，但更早地到達穩定期有助于在發酵高峰期累積大量菌體，從而提高ε-PL 產量。

圖2 分批發酵過程中L-谷氨酸添加時機對菌體生長和ε-PL 合成影響Fig.2 Effect of L-glutamate acid feeding time on cell growth and ε-PL production during batch fermentation by Streptomyces sp. M-Z18 in 5 L fermenter at pH 3.8

圖3 補料-分批發酵中流加(A)和未流加(B)L-谷氨酸的ε-PL 發酵過程參數比較Fig.3 Comparison of ε-PL fed-batch fermentation process with and without L-glutamate acid feeding by Streptomyces sp. M-Z18 in 5 L fermenter at pH3.8

3 討論

本研究以1 株S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸抗性ε-PL 突變株Streptomyces sp. M-Z18 為對象，借助L-谷氨酸流加策略，實現ε-PL 補料-分批發酵產量和產率分別達到31.65 g/L 和4.36 g/(L·d)，比原有發酵工藝分別提高49.2%和43.9%。可見，發酵過程中連續流加L-谷氨酸為進一步提高S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸抗性突變株ε-PL 合成能力提供了參考。

L-谷氨酸提高ε-PL 合成能力的可能機制在于:L-谷氨酸通過轉氨作用為ε-PL 合成前體L-賴氨酸合成過程提供氮骨架，同時生成的α-酮戊二酸進入三羧酸循環又進一步提供碳骨架，從而增加了L-賴氨酸合成能力，進而加快了ε-PL 合成，最終導致ε-PL產量提升。顯然，上述L-谷氨酸的雙重作用(碳源+氮源)還有待于利用穩定性同位素標記、關鍵酶活性和代謝通量分析等實驗加以證實。

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