大腸桿菌中芥藍抗壞血酸過氧化物酶基因的高效表達*

黃加保，唐蕾，華子安，毛忠貴

1(江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2 (江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate peroxidase，Apx，EC1. 11. 1.11)，也稱維生素C 過氧化物酶，是一種以抗壞血酸(Ascorbic acid，AsA)為電子供體的過氧化物酶。1976 年Foyer 和Halliwell［1］在菠菜葉中發現了一種脫氫抗壞血酸還原酶，1981 年Nakano和Asada［2］將其正式定名為Apx。Apx 主要存在于高等植物、真核藻類及某些藍細菌中。在高等植物中，已報道4 種不同細胞定位的Apx 同工酶，它們分別為:葉綠體基質Apx(sApx)、類囊體膜Apx(tApx)、微體Apx(mbApx)和胞質Apx(cApx)［3］。Apx 在植物中有特定的生理功能，是清除植物體內H2O2的關鍵酶之一，同時在植物抗逆性、果蔬采后品質變化等方面也發揮著重要作用。

芥藍(Brassica alboglabra L. )是十字花科蕓薹屬草本植物，屬甘藍的一個變種［4］，原產于中國南部，是我國著名的特產蔬菜之一，主要以花薹為產品，在廣東、福建等省栽培。芥藍具有很高的營養價值，含有豐富的維生素、礦物質和芥子油苷等，特別是維生素C 含量很高［5-7］。維生素C 是Apx 的底物，其含量的高低與Apx 的活性密切相關。人們已研究了茶葉［8］、擬南芥［9］、大豆［10］、鹽地堿蓬［11］等植物的Apx，但與芥藍Apx 相關的研究尚未見報道。直接從芥藍中分離純化Apx，工序復雜，耗時耗力，且不易實現大規模制備。本研究旨在通過基因工程方法從芥藍幼苗葉中擴增apx 基因，并將其轉入大腸桿菌中表達。重組蛋白經簡單的Ni2+柱純化就能大量制備，為進一步研究Apx 的生理特性和功能打下一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

宿主菌E. coil BL21 由本實驗室保藏，表達質粒pET-28a 購于Novagen 公司。

1.1.2 培養基

固體瓊脂培養基:2%瓊脂，自來水。

LB 液體培養基:酵母提取物5 g /L，胰蛋白胨10 g /L，NaCl 10 g /L，pH 7.0 ～7.4。

LB 固體培養基:LB 液體培養基中加入2%的瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取及cDNA 的合成

芥藍無菌苗的種植 選取籽粒飽滿的芥藍種子(北京南無科貿有限責任公司)先用70%的乙醇浸泡1 min 后無菌水沖洗3 次，再用10% 雙氧水浸泡5 min，無菌水沖洗5 次。無菌環境下將種子接到滅菌的固體瓊脂培養基中，26℃光照培養箱中培養1 周，光照時間為8 h/d。

總RNA 的提取 采用改進的CTAB-LiCl 沉淀法［12］，從生長1 周的幼苗葉中提取總RNA，利用Reverse Transcriptase M-MLV(大連寶生物工程有限公司)合成cDNA 鏈。以cDNA 為模板進行RT -PCR及RACE 擴增。

1.2.2 apx 基因擴增

根據GenBank 公布的蕓薹屬植物過氧化物酶基因序列，以保守序列為參照(引物見表1 apx fra)，得到apx 部分基因，之后按照5’-Full RACE Kit 和3’-Full RACE Core Set Ver.2.0(大連寶生物工程有限公司)中的操作說明，分別進行5’-RACE 和3’-RACE擴增。擴增引物見表1。對擴增產物進行測序，用DNAMAN V6 軟件進行序列拼接，最后得到apx 基因全序列。根據基因全序列設計帶有限制性酶切位點的引物(見表1 apx ful)，進行RT-PCR 擴增、純化、構建質粒。

表1 apx 基因擴增引物序列Table 1 Sequences of primers for apx gene amplification

1.2.3 pET-28a-apx 的構建及克隆

將RT-PCR 的純化產物及載體pET-28a 經BamHⅠ和NotⅠ雙酶切后連接，構建重組質粒pET-28aapx。將pET-28a-apx 轉化E. coil BL21 感受態細胞，涂布于含100 μg/mL 卡那霉素(kanamycin，kan)的LB 平板上，37℃培養過夜。挑取單菌落接種于含kan (100 μg/mL)的LB 液體培養基中培養，收集細胞，用MiniBEST Plasmid Purification Kit(大連寶生物工程有限公司)提取質粒，雙酶切驗證。將篩選的陽性重組菌置于甘油管中-20℃保存。

1.2.4 重組蛋白表達鑒定及條件優化

重組蛋白表達鑒定 將陽性重組菌于37℃，200 r/min 培養過夜，以2%的接種量轉接至含有kan 的新鮮LB 液體培養基中，相同條件下培養2.5 h 左右，至OD600達到0.6，向培養基中加入終濃度為1 mmol/L 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)，37℃，200 r/min，誘導表達4 h，收獲菌體。用20 mmol/L (pH7.5)的Tris-HCl 緩沖液(含有質量分數為0.1%脫氧膽酸鈉)懸浮菌體，濕菌體與緩沖液的比例為1∶16 (W/V)。200 w，工作1 s，間歇3 s，超聲破碎15 min。10 000 r/min 離心25 min 得到上清液，測定酶活性并進行SDS-PAGE 電泳鑒定。

表達條件優化 采用單因素實驗，誘導條件:溫度為16、23、30 和37℃，IPTG 的終濃度為0.05、0.1、0.2和0.3 mmol/L (不加IPTG 為對照);誘導時間為0、4、8 、10 和12 h，收獲菌體，懸浮，破碎離心，測定上清液酶活力和蛋白濃度，計算比酶活。

1.2.5 酶活力及蛋白濃度的測定

參照沈文飚［13］的方法并加以改進。200 μL 的反應體系:依次加入終濃度為0.5 mmol/L 乙二胺四乙酸，0.5 mmol/L AsA，50 mmol/L 磷酸緩沖液(pH7.0)和適量酶液，最后加入終濃度為0.2 mmol/L H2O2啟動反應，室溫下測定290 nm 處的吸光值，記錄反應30 s 內吸光值的變化(△OD)。以1min 氧化1 μmol AsA 的酶量作為1 個酶活性單位(U)。比酶活= U/蛋白質濃度(U/g)。

蛋白質濃度測定采用BCA 試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)，以牛血清蛋白為標準蛋白。

1.2.6 重組蛋白純化及最適酶反應條件測定

重組蛋白純化采用Akata avant 純化系統。將23℃，0.2 mmol/L IPTG 誘導培養10 h 的菌液離心沉淀，以結合緩沖液(20 mmol/L 磷酸緩沖液，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH7.4)重懸菌體，濕菌體與緩沖液的比例為1∶16 (W/V)。超聲破碎后離心收集上清液，上樣至預先平衡的Histrap FF crude柱(GE Healthcare，Life Science)，按照說明書操作方法，純化重組Apx，純化后的樣品進行SDS-PAGE 鑒定及酶活性測定。

酶的最適反應條件測定將純化后的酶蛋白在不同溫度(20、25、30、35、40、45℃)和不同的pH (3、4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、9)下測定酶活，將最高酶活計為100%，計算相對酶活。

1.2.7 數據分析

采用SPSS 13.0 軟件對數據進行方差分析。

2 結果與討論

2.1 芥藍Apx 編碼基因的獲得

根據GenBank 公布的蕓薹屬植物過氧化物酶的基因序列，以保守序列為參照，設計引物apx fra，以芥藍cDNA 為模板RT-PCR 得到400 bp 左右條帶(圖1A)，將該條帶割膠純化測序，依照測序結果設計apx 3’和5’RACE 引物，分別得到700 bp (圖1C)和550 bp (圖1B)左右的3’及5’RACE 產物，將產物測序后用DNAMAN V6 軟件拼接，得到apx 基因序列全長(GenBank 登錄號:KC894750)。

圖1 PCR 擴增apx 基因片段電泳圖Fig.1 Electrophoresis diagram of apx amplification fragments by PCR

采用DNAMAN V6 軟件分析得到芥藍apx 編碼區全長為753 bp，ATG 是起始密碼，TAA 為終止密碼，共250 氨基酸，分子質量推算約為27.6 kDa。將apx 在NCBI 中BLAST 比對，該基因與蕓薹屬甘藍apx 的序列相似度高達99%。初步鑒定該apx 屬于芥藍抗壞血酸過氧化物酶的胞質同工酶基因。

2.2 pET-28a-apx 在E. coil BL21 克隆表達

將apx 編碼基因插入表達載體pET-28a，構建的重組質粒pET-28a-apx 轉化至E. coil BL21 中，擴增后提取質粒，酶切、瓊脂糖凝膠電泳驗證，結果表明:重組質粒經BamH I 和Not I 雙酶切、電泳后，在6 000 bp 和750 bp 各出現了一條帶，分別為質粒和目的基因，說明重組質粒構建成功(圖2)。

圖2 pET-28a-apx 雙酶切鑒定電泳圖Fig.2 Electrophoresis diagram of pET-28a-apx digested by two restriction enzymes

分別收集含有pET-28a 及pET-28a-apx 質粒的E. coil BL21 細胞，并將細胞破碎，離心得到上清液，進行SDS-PAGE，結果表明，在含有pET-28a-apx 質粒，并經IPTG 誘導的細胞上清液中，有明顯的目的蛋白條帶，分子質量為29 kDa (圖3)。

圖3 Apx 表達及純化的SDS-PAGE 圖譜Fig.3 SDS-PAGE showing Apx expression and purification

2.3 重組蛋白pET-28a-apx 表達條件優化

為了提高重組蛋白的酶活性，本文對影響酶表達水平的關鍵因子即誘導劑濃度、誘導時間和溫度進行了研究。結果表明當IPTG 濃度為0.2 mmol/L 時，Apx 比酶活最大，相比對照提高了25%，當IPTG 的濃度小于0.2 mmol/L，比酶活隨濃度的升高有一定程度的提高，當IPTG 的濃度繼續升高時，比酶活下降(圖4 A)。當IPTG 誘導時間為10 h 時，比酶活達到最大，小于10 h 時，隨誘導時間的加長，比酶活有顯著的提高，當誘導時間大于10 h 時，比酶活較10 h下降了28% (圖4 B)。分析原因可能是在誘導前期，菌體的活力及蛋白表達量逐漸升高，蛋白降解率低，酶活升高;隨誘導時間的延長(＞10 h)，菌體活力明顯下降，蛋白表達量降低，蛋白降解率升高，酶活降低。

溫度對重組蛋白的表達有顯著影響，有研究報道表明，在較低溫度(23℃)下，菌體的比生長速率較低，但菌體不易自溶，菌體活力及質粒穩定性升高，代謝副產物的生成減少，蛋白表達更多。并且低溫降低了熱激蛋白及蛋白酶的合成，也降低了重組蛋白的合成速率，使之與蛋白的折疊速率更相近，更多的形成可溶的有活性的蛋白。溫度太低(16℃)，菌體的生長明顯受抑制，蛋白表達不足，酶活降低［14］。本文中誘導溫度為23℃(圖4 C)，Apx 比酶活達到最高，溫度太低(16℃)或太高(37℃)，都會影響重組蛋白的表達。

圖4 表達條件對重組蛋白Apx 酶活性的影響Fig.4 Effect of expression conditions on recombinant Apx activity

2.4 重組蛋白純化及酶最適反應條件

將重組蛋白經Ni2+柱純化，去除雜蛋白(圖3)，并進行酶的最適pH 和溫度測定。結果表明:該酶的最適pH 值為6.5，當pH 在4 ～7.5 時，酶活均為最高酶活的80%以上(圖5)。最適溫度為40℃，而當溫度在30 ～40℃時，酶活均較高，在最高酶活的90%以上，且變化不顯著(圖6)。

圖5 pH 對Apx 酶活性的影響Fig.5 Effect of pH on Apx activity

圖6 溫度對Apx 酶活性的影響Fig.6 Effect of temperature on Apx activity

3 結論

研究葉菜類植物Apx 的性質，對于控制采后蔬菜品質的變化具有十分重要的意義。與直接從芥藍中提取Apx 相比，芥藍apx 基因在工程菌中表達，具有培養周期短、成本低、表達過程易于控制等諸多優點，且apx 基因受啟動子基因調控，通過外源物添加及誘導條件優化等方法可誘導apx 高效表達。此外，在apx 基因兩端添加His 標簽，容易分離純化Apx，為更好地研究其酶學性質、蛋白結構及生物學特性等奠定了基礎。本研究主要得到了以下結論:

首先，通過RNA 提取，RT-PCR，RACE 等從芥藍幼苗中擴增出了apx 基因全序列，在NCBI 庫中比對，初步證實為胞質apx。與甘藍apx 相似度高達99%。其次，用雙酶切的方法構建了pET-28a-apx，并在E.coil BL21 中成功表達。通過誘導條件的單因素優化，得到apx 誘導表達的最適條件為:添加0.2 mmol/L IPTG，23℃誘導培養10 h。最后，用AKata avant 純化系統及鎳柱純化出電泳純Apx，得出pH6.5 和40℃是該酶的最適反應條件。

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