注射用鹽酸吉西他濱細菌內毒素檢查方法的研究

周 梅，武 谷（安徽省食品藥品檢驗所，合肥 230051）

鹽酸吉西他濱全稱為2′-脫氧-2′，2-二氟胞嘧啶鹽酸鹽（β異構體），其結構與阿糖胞苷類似，是新一代抗代謝藥。鹽酸吉西他濱作為一種前藥在細胞內是脫氧胸苷激酶磷酸化的良好底物。注射用鹽酸吉西他濱（β異構體）為注射用無菌凍干粉末，用于治療局部晚期或已轉移的非小細胞肺癌[1]。現有國家標準采用熱原方法進行其生物安全性質量檢查。筆者按照《中國藥典》2010年版（二部）“細菌內毒素檢查法”[2]，對注射用鹽酸吉西他濱進行了細菌內毒素檢查方法的研究，以探討其代替熱原檢查法的可行性。

1 材料

1.1 儀器

S648恒溫水浴鍋（上海醫療器械七廠）；HS-1300凈化工作臺（蘇凈集團安泰公司）；MS3digital旋渦混旋器（德國IKA公司）；試驗所用容器和用具均經250℃干烤2 h。

1.2 藥品與試劑

注射用鹽酸吉西他濱（浙江海正藥業股份有限公司，批號：20100924、20100925、20100926，規格：每支0.2 g）；細菌內毒素工作標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號：150601-200966，規格：每支120 EU）；鱟試劑（湛江博康海洋生物有限公司，批號：10103012；福州新北生化工業有限公司，批號：1106010；靈敏度：均為0.25 EU/ml）；細菌內毒素檢查用水（BET，福州新北生化工業有限公司，批號：10060321，規格：每支100 ml）。

2 方法與結果

2.1 鱟試劑靈敏度復核

用BET將細菌內毒素工作標準品溶解，置于混旋器混合15 min，然后制成0.5、0.25、0.125、0.062 6 EU/ml的稀釋液，依據《中國藥典》[2]2010年版二部附錄方法[2]進行復核試驗。結果，鱟試劑靈敏度的測定值（λc）均在0.5λ～2λ之間，表明所用鱟試劑均可用于細菌內毒素檢查，結果詳見表1（表中“+”表示凝膠形成，“-”表示凝膠未形成）。

表1 鱟試劑靈敏度復核結果Tab1 TALsensitivity check results

2.2 細菌內毒素理論限值的確定[3]

參考注射用鹽酸吉西他濱的說明書，其臨床使用最大劑量為1 250 mg/m2（人的體表面積按1.62 m2計），因此M（M為人用每千克體質量每小時的最大供試品劑量）定為1 250×1.62/60（kg·h）；內毒素限值（L）按公式L＝K/M（K為人每千克體質量每小時最大可接受的內毒素劑量）計算：L＝5 EU/（kg·h）×60 kg×1 h/1 250/1.62 mg＝0.148 EU/mg。根據《中國藥典》2010年版（二部）“化學藥品注射劑安全性檢查法應用指導原則”要求[2]，細菌內毒素檢查限值按規定要求計算，由于藥物和適應證（如抗感染、抗腫瘤、心血管藥等急重病癥用藥，兒童老人用藥，復合用藥，大輸液等）的不同，限值可適當嚴格，即至計算值的1/3～1/2，以保證安全用藥。因此將注射用鹽酸吉西他濱細菌內毒素理論限值確定為每1 mg吉西他濱中含細菌內毒素的量不得過0.10 EU。

2.3干擾試驗最小有效稀釋質量濃度c（mg/ml）的計算

根據公式：最大有效稀釋倍數（MVD）＝cL/λ，并考慮到目前市售鱟試劑有0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.03 EU/ml 5種靈敏度，對于規格為0.2 g的樣品MVD0.5-0.03＝0.14 EU/mg×200 mg/ml/（0.5～0.03）EU/ml＝56倍～933倍，則該品種最小有效稀釋質量濃度c為3.57～0.214 mg/ml。

2.4 內毒素標準品的稀釋

用BET將細菌內毒素工作標準品稀釋成0.5、0.25、0.125、0.062 5 EU/ml系列內毒素溶液備用，作為Es系列。

2.5 供試品的干擾預試驗[4]

為確定注射用鹽酸吉西他濱對方法的影響，首先采用直接稀釋法進行供試品干擾預試驗。用BET將樣品溶解，制備成不同質量濃度的溶液：0.25、0.5、1.0、2.0、3.5、7.0 mg/ml溶液，記為SW系列；另再分別制備1份同樣質量濃度的供試品溶液，在制備中加入內毒素工作標準品，使每一水平的樣品溶液中含2λc的內毒素，記為SE系列。選用靈敏度λc為0.25 EU/ml的鱟試劑分別與SW和SE反應，相應得供試品陰性對照（NPC）系列和供試品陽性對照（PPC）系列，每一稀釋質量濃度平行做2個反應管，同時做BET陰性對照（NC）和陽性對照（PC）。結果發現，如果采用直接稀釋法，即使將供試品稀釋至0.25 mg/ml時對細菌內毒素和鱟試劑的反應也有干擾。

取注射用鹽酸吉西他濱1支，加BET 10 ml，搖勻，測其pH值為3.07。由于細菌內毒素檢查試驗pH值最佳范圍為6.0～8.0，因此將上述溶液調節pH值在6.0～8.0之間，再進行干擾預試驗。稱取碳酸鈉適量置于無菌容器中，加BET制備成1 mol/L的溶液；取注射用鹽酸吉西他濱1支，加BET 10 ml，搖勻，取碳酸鈉溶液適量加入此溶液中，調節pH值至7.0，再進行干擾預試驗，結果見表2。

表2 供試品干擾預試驗結果Tab2 Results of interference pretest of samples

表2結果表明，供試品質量濃度在0.25～3.5 mg/ml時對細菌內毒素和鱟試劑的反應未見干擾，故取供試品質量濃度為3.5 mg/ml進行干擾試驗以進一步驗證。

2.6 供試品干擾試驗

取注射用鹽酸吉西他濱1支，加BET 10 ml，搖勻，取1 mol/L的碳酸鈉溶液適量加入此溶液中，調節pH值至7.0，再用BET稀釋至3.5 mg/ml。采用2個不同廠家的鱟試劑，按2010年版《中國藥典》（二部）附錄[2]方法進行試驗，結果見表3。

表3 供試品干擾試驗結果Tab3 Results of interference test of samples

從表3結果可知，上述供試品的Et均在0.5Es～2.0Es之間，即供試品質量濃度在3.5 mg/ml時與2個廠家的鱟試劑試驗均不產生干擾。根據公式MVD＝cL/λ，當供試品為注射用無菌粉末時MVD取1，計算此時L值為0.07 EU/mg，低于確定的理論值。因此可采用L值為0.10 EU/mg對注射用鹽酸吉西他濱進行細菌內毒素檢查。

2.7 樣品細菌內毒素檢查

取注射用鹽酸吉西他濱1瓶，加BET 10 ml溶解，再加碳酸鈉溶液適量（調pH至7.0），用BET將樣品稀釋成2.5 mg/ml（L值為0.10 EU/mg）的溶液，用靈敏度為0.25 EU/ml的鱟試劑檢查，結果見表4。

表4 樣品中細菌內毒素檢查結果Tab4 Results of endotoxin detection of samples

表4檢測結果顯示，樣品中細菌內毒素含量均低于0.10 EU/mg。

3 討論

細菌內毒素檢查法是通過鱟試劑與細菌內毒素間產生凝聚反應以判斷供試品中細菌內毒素是否符合規定的一種方法，其具有操作簡單、檢測周期短、靈敏度高、結果準確等優點，可替代家兔熱原檢查法用于注射液的質量控制。由于不同廠家生產的鱟試劑的抗干擾能力存在差別，為保證試驗結果的可靠性，該試驗一般選擇2個廠家生產的鱟試劑對樣品進行干擾試驗。通過預試驗發現，本品對鱟試劑凝集反應具有較強的抑制作用，僅通過稀釋的方法不能排除干擾。為此，筆者分析了該藥的組成及溶液的pH值。由于本品的主要成分為鹽酸吉西他濱，輔料為甘露醇、醋酸鈉和氫氧化鈉，測其pH值為3.07，而適合鱟試劑反應水平的pH值范圍為6.0～8.0，藥物pH值偏酸或偏堿，超出了鱟試劑緩沖能力就會抑制或促進凝聚的形成。因此，本試驗采用1 mol/L的碳酸鈉溶液調pH值至7.0。結果表明調pH值后再稀釋至3.5 mg/ml時就可以排除本品對鱟試劑凝集反應的干擾作用。因此將L值定為0.10 EU/mg，并認為注射用鹽酸吉西他濱采用細菌內毒素檢查法代替家兔熱原檢查法進行生物安全性質量檢查是可行的。

[1]金薇，楊永健.高效毛細管電泳分離和測定注射用鹽酸吉西他濱中有關物質[J].藥物分析雜志，2004，24（5）：476.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010年：附錄99-102.

[3]國家藥典委員會.臨床用藥須知：二部[S].2000年版.北京：化學工業出版社，2000：573.

[4]葉青，王偉，迪麗努爾·沙比托夫.鹽酸多巴胺注射液細菌內毒素檢查方法的研究[J].中國藥房，2010，21（41）：3 918.