LC-MS/MS法測定大鼠血漿中維拉帕米與其代謝產物去甲維拉帕米的濃度及其藥動學研究

鄭俠，劉昌輝，王寧生，宓穗卿（.廣州中醫藥大學臨床藥理研究所，廣州50405；2.廣東省醫學實驗動物中心，廣東佛山 528248）

維拉帕米（Verapamil，Ver）屬于第1代苯基烷胺類鈣離子通道拮抗藥，臨床上被廣泛應用于治療心律失常、高血壓、缺血性心臟病以及肥厚性心肌病等。近年Ver在陣發性室上性心動過速方面研究也有報道[1-2]。Ver口服給藥后吸收迅速，首關代謝強，生物利用度低（10%～20%）[3]。去甲維拉帕米（Norverapamil，Nor）是Ver的主要代謝產物之一，其主要由細胞色素P450（CYP）3A4酶代謝[4]。筆者建立一種快速、靈敏、簡便、取樣量少的液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）法檢測Ver與Nor在大鼠體內的血藥濃度，旨在為臨床進行藥動學研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

API4000型LC-MS/MS儀，包括電噴霧離子源（ESI）、數據處理系統（美國AB公司）；1200型液相色譜系統（美國Agilent公司）。

1.2 藥品與試劑

Ver對照品（批號：V4629，純度：＞98%）、Nor對照品（批號：V108-20MG，純度：＞98%）和他莫昔芬對照品（內標，批號：T5648，純度：＞99%）均購于美國Sigma公司；甲醇、甲酸為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3 動物

SD大鼠6只，♂，體質量（280±30）g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCKX（粵）2008-0002。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

精密稱取Ver、Nor和內標對照品各10 mg，分別置于10 ml量瓶中，加5 ml甲醇使其溶解，用甲醇定容至10 ml，得1 mg/ml的母液，用時用甲醇稀釋至所需質量濃度即可。

2.2 色譜條件與質譜條件

色譜柱：Alltima-C18（150 mm×2.1 mm，5 μm），保護柱：Alltima-C18；流動相：甲醇-0.05%甲酸水（梯度洗脫，具體程序：0～0.1 min為0→45%甲醇，0.1～0.6 min為45%甲醇，0.6～1.1 min為45%→98%甲醇，1.1～7.3 min為98%甲醇，7.3～8.3 min為98%→45%甲醇，8.3～14.5 min為45%甲醇），流速：0.3 ml/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μl。

ESI源；檢測方式：正離子檢測；掃描方式：多反應離子監測（MRM）；Ver、Nor和他莫昔芬的選擇檢測離子質荷比（m/z）分別為 455.3/165.0（[M+1]+）、441.0/165.0（[M+1]+）、372.2/129.1（[M+1]+）；霧化氣流速：30 L/min；干燥氣流速：30 L/min；干燥氣溫度：400℃；檢測器電壓：4 500 V。

2.3 血漿樣品的采集與處理

2.3.1 血漿樣品的采集：取大鼠6只，實驗前12 h禁食不禁水，參照文獻[5]擬定藥動學研究方案，灌胃給藥Ver 10 mg/kg，于給藥前和給藥后0.17、0.25、0.5、1、2，3、4、6、8、12、24 h眼眶靜脈叢采血100 μl，置于1.5 ml肝素化的塑料管中，于4 ℃、1 500×g離心10 min分離血漿，置于－80℃冷凍貯存備用。

2.3.2 血漿樣品的處理：取血漿20 μl，加入1 μg/ml內標對照品溶液5 μl，渦旋振蕩30 s，加入甲醇100 μl，渦旋振蕩3 min，16 000×g離心10 min，取上清液5 μl進樣測定。

2.4 方法專屬性考察

取大鼠空白血漿、空白血漿+Ver+Nor+內標、血漿樣品（給藥后2 h）+內標，依法處理后進樣測定。結果顯示，空白血漿對檢測無干擾，Ver、Nor和內標的保留時間分別為5.78、5.77、6.77 min。色譜圖見圖1。

圖1 液相色譜-串聯質譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+Ver+Nor+內標；C.血漿樣品+內標Fig1 LC-MS/MS chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+Ver+Nor+internal standard；C.plasma sample+internal standard

2.5 線性關系與最低檢測限考察

取空白血漿20 μl，加入一定質量濃度的Ver、Nor對照品溶液 5 μl，制成Ver、Nor均為2、5、10、20、50、100、200、500、1 000 ng/ml的血漿樣品，按“2.3.2”項下方法處理，進樣測定。以Ver、Nor質量濃度（c）為橫坐標，Ver、Nor分別與內標的峰面積之比（Y）為縱坐標，進行線性回歸。得Ver、Nor的回歸方程分別為：Y＝20.539c－0.940 4（r＝0.999 4）、Y＝47.789c+0.503 9（r＝0.999 2），二者檢測質量濃度的線性范圍均為2～1 000 ng/ml，最低檢測限均為0.5 ng/ml（信噪比＞3）。

2.6 回收率與精密度試驗

取空白血漿20 μl，制備成Ver、Nor質量濃度分別為5、50、500 ng/ml的血漿樣品，按“2.3.2”項下方法處理，進行5樣本分析，連續測定3 d，根據當日標準曲線計算樣品質量濃度，分別計算絕對回收率、相對回收率、日內RSD、日間RSD，結果見表1。

表1 回收率與精密度試驗結果（n＝5）Tab 1Results of recovery and precision tests（n＝5）

2.7 穩定性考察

取大鼠空白血漿20 μl，制備成Ver、Nor質量濃度分別為5、50、500 ng/ml的血漿樣品，室溫放置28 d（測定時間為放置1、7、14、21、28 d）及－80℃反復凍融5次（測定時間為凍融后2、4、6、8、10 h），于相應測定時間測定Ver與Nor的質量濃度。結果，3個質量濃度血漿樣品中Ver與Nor的RSD均＜5%，表明Ver與Nor在室溫放置及反復凍融條件下均穩定。

2.8 藥動學實驗

取“2.3.1”項下各時間點的血漿樣品，處理后進樣測定Ver與Nor的血藥濃度，繪制藥-時曲線。用3p97軟件計算藥動學參數。Ver和Nor在大鼠體內的藥-時曲線見圖2，藥動學參數見表2。

圖2 Ver和Nor在大鼠體內的藥-時曲線（n＝6）Fig2 Plasma concentration-time profiles of Ver and Nor in rats（n＝6）

表2 Ver和Nor在大鼠體內的藥動學參數（±s，n＝6）Tab2 Pharmacokinetic parameters of Ver and Nor in rats（±s，n＝6）

表2 Ver和Nor在大鼠體內的藥動學參數（±s，n＝6）Tab2 Pharmacokinetic parameters of Ver and Nor in rats（±s，n＝6）

參數Ke，/h t1/2，h tmax，h cmax，ng/ml AUC0-24 h，ng·h/ml AUC0-∞，ng·h/ml Ver 0.307±0.014 2.26±0.31 0.48±0.23 669.91±80.99 1 320.78±165.04 1 331.33±165.20 Nor 0.286±0.029 2.44±0.29 1.26±0.47 681.86±79.79 2 179.68±275.99 2 341.66±201.20

由上述結果表明，Ver和Nor在大鼠體內的藥動學符合二房室模型。

3 討論

Ver藥動學研究在國內已有相關報道[6-7]，但采用LC-MS/MS同時測定Ver及其代謝產物Nor在大鼠體內血藥濃度的方法在國內尚未見文獻報道。本文建立的方法，每個樣本僅需血漿100 μl，整個藥動學研究過程采血量少，一只大鼠可完成一條完整的藥-時曲線，且在整個采血過程中大鼠的狀態比較好，這樣就能更真實地反映Ver在大鼠體內的藥動學過程。

在建立LC-MS/MS法的預實驗中，筆者曾選用等度洗脫，洗脫時間為5 min，但是峰形較差、響應值不高。通過調節pH、流速和流動相比例，峰形、響應值都有所改善，但效果不是很理想。而采用梯度洗脫，雖然分析時間延長了，但峰形和響應值都有了很大改善。等度洗脫時，Ver、Nor和內標的半峰寬分別是0.4、0.4、0.5 min；而梯度洗脫時，Ver、Nor和內標的半峰寬分別是0.1、0.1、0.3 min，大大提高了檢測的靈敏度。本研究建立的方法可為臨床上Ver的藥動學研究提供可靠的參考。

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