辣椒花藥培養影響因素的研究

龔明霞 ，何鐵光 ，2，董文斌 ，趙坤 ，王益奎 ，王日升 ，康德賢

（1.廣西農業科學院蔬菜研究所，南寧，530007；2.廣西農業科學院農業資源與環境研究所）

辣椒（Capsicum annuum L.）是一種重要的蔬菜作物和調味品，在中國種植面積已超過130萬hm2，位列世界之首。花藥培養是人工產生單倍體的關鍵技術，通過花藥培養單倍體途徑加速親本純系的選育，提高親本優異基因的聚合是目前辣椒育種的重要途徑之一。辣椒花藥培養研究開始較早[1，2]，國內外學者從培養基[3]、小孢子發育時期[5]、活性炭[6]、溫光培養條件[7]等方面做過研究。花藥培養技術雖有許多優勢，但目前辣椒花藥培養還有大量的具體問題需要探索，如辣椒花藥培養胚狀體的誘導效果隨基因型的不同而存在很大差異，在實際應用中，需要對有價值的不同基因型的辣椒材料進行研究，以提高辣椒單倍體的誘導效率。本研究以不同果型和不同基因型的優良辣椒雜交F1代、優良辣椒品系花藥為材料，研究其胚狀體和愈傷組織誘導及繼代生長的影響因素，以提高不同果型辣椒花藥培養的出胚率、出愈率和愈傷組織的質量，推動這幾個優良辣椒品系的花藥培養在辣椒育種方面的應用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料有雜交種F1代植株花藥，分別為Fk（M）×Fk（F）、Fk（F）×Fk（M）、1-8-3×1-8-8、HX-1×TW-1，另外2個基因型材料為1個不育系A和1個保持系B（A、B均由中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所提供）。

1.2 試驗方法

①材料種植和采樣方法 2010年8月中旬浸種催芽，在塑料育苗盤中育苗，9月中旬移栽辣椒苗定植于大棚中，11月下旬開始采樣。采集萼瓣一致，長約3 mm的幼蕾，每株選取2～3個，采下后裝入自封口塑料袋，隨即放入裝有冰塊的泡沫箱中，然后帶回實驗室，放入4℃的冰箱進行低溫預處理7 d。

②接種方法 接種當天，從冰箱中拿出花蕾材料，在室溫中放置約1 h。然后于超凈工作臺上，先用75%酒精浸泡消毒約30 s后，用無菌水清洗1次，再用加有2～3滴吐溫-80的0.1%HgCl2溶液浸泡消毒8～9 min，每2 min晃動一次使之與消毒液充分接觸，最后用無菌水浸洗4～5次，傾倒無菌水，用鑷子夾出，放在無菌濾紙上吸干水分后，剝出花藥，接種至培養基上。

③培養方法 接種完畢后，將培養瓶放置培養箱中進行黑暗培養10 d，培養溫度為30℃，再從培養箱中取出置光暗交替條件下培養，16 h光照/8 h黑暗，溫度為（28±1）℃。

1.3 數據分析

接種 15 d后統計并剔除有污染的花藥培養瓶，期間觀察和記錄愈傷組織誘導和生長狀況，接種40 d后統計辣椒花藥褐化數、胚狀體和愈傷組織誘導情況，并計算花藥污染率、褐化率及愈傷組織誘導率。

計算公式如下：污染率（%）=（污染花藥數/接種花藥總數）×100%；褐化率（%）=（花藥褐化數/無污染花藥總數）×100%；出胚率（%）=（誘導出胚狀體的花藥數/無污染花數總數）×100%；愈傷組織誘導率 （%）=（愈傷組織發生數/無污染花藥總數）×100%。

2 結果與分析

2.1 不同基因型辣椒花蕾的消毒效果比較

將不同基因型的辣椒花蕾用同一種方法進行消毒處理，接種后的部分花藥在2～3 d后污染，但因基因型的不同受污染的情況有差異（表1）。6個辣椒品種中有一半未受污染，其中2個品種的污染率較低，最高的污染率為23.08%，這說明采用此消毒方法效果較好。另外說明在秋冬季采取辣椒的花蕾比較容易消毒。

2.2 基因型對辣椒花藥愈傷組織和胚狀體誘導的影響

表1 不同基因型辣椒花藥消毒效果比較

表2 基因型對辣椒花藥愈傷組織和胚狀體誘導的影響

將辣椒的花藥接種至培養基10 d后，大部分花藥在培養基上呈黃白色或黃綠色，沒有發生褐變，且能夠膨大生長，只有少數花藥完全變成黑褐色死亡狀；接種35 d后有些品種有很少量的胚狀體形成；接種40 d后，大部分膨大生長的花藥都能夠形成白色愈傷組織，大部分的愈傷組織質地致密，表面有毛狀物，少數較疏松，個別松散為顆粒透明狀，而有些花藥既沒有形成愈傷組織，也不分化出胚狀體，只是膨大生長，花藥表面呈綠色。從表2中可以看出，不同果型的辣椒花藥培養時胚狀體的誘導率不同，大果型的 Fk（M）×Fk（F）和 Fk（F）×Fk（M）雜交的F1代植株花藥胚狀體誘導率最高，為1.38%，小果型的HX-1×TW-1雜交的F1代植株花藥不能誘導出胚狀體；辣椒花藥出愈率因基因型不同而有差異，Fk（M）×Fk（F）的 F1代植株花藥出愈率最高，比最低的高51.79個百分點；不同基因型辣椒花藥的死亡率不同，最高的死亡率為40.00%，比最低的高31.67個百分點。

2.3 接種量對辣椒花藥出胚率和出愈率的影響

研究了每瓶接種的花藥數量對胚狀體和愈傷組織形成的影響。結果表明（表3），培養瓶中花藥接種量越大，出愈率越高，死亡率越低，但出胚率差異不明顯。如對于HX-1×TW-1的F1代植株花藥，每瓶接種2個花蕾的花藥比1個的出愈率高13.24個百分點，但對于其他4個品種來說，接種量導致的出愈率變幅為0.77～24.19個百分點，可見接種量對辣椒花藥愈傷形成的影響因品種而異。另一方面，接種量不同所引起的花藥死亡率變幅為2.79～13.32個百分點，這種差異因品種而異，如對于HX-1×TW-1的F1代植株花藥來說，接種量增大后死亡率降低了13.32個百分點。

2.4 基因型和接種量對愈傷組織繼代培養的影響

為了探明辣椒花藥愈傷組織在繼代培養過程中能否繼續分化出胚狀體，研究了基因型和接種量對愈傷組織繼代培養的影響。轉接40 d后統計結果發現，辣椒花藥愈傷組織在繼代培養中容易變褐并逐漸死亡。從表4可知，每瓶接種量對辣椒花藥愈傷組織繼代培養的影響因品種而異，有的表現出接種量多成活率高，如 Fk（F）×Fk（M）的 F1代植株的花藥愈傷，接種量為每瓶10塊的比6塊的成活率高20.91個百分點；有些表現出接種量少成活率高，如不育系A植株的花藥愈傷，每瓶接種6塊的比10塊的成活率高26.28個百分點。但所有成活的愈傷組織繼代培養1次，均不能夠分化出胚狀體，說明從愈傷組織中分化出胚狀體比較困難。

3 小結與討論

辣椒花藥培養首先要對花蕾表面進行消毒，試驗中由于消毒不嚴格，有時材料會全部受到污染，所以材料消毒是關系到花藥培養成敗的第一個關鍵技術問題。本試驗所采用的辣椒花蕾消毒方法效果較好，一半材料未受到污染。這不僅與材料的預處理有關，還與材料的選擇及消毒技術有關。

供體植株基因型是影響花藥培養的關鍵因素。本研究表明，辣椒花藥胚狀體誘導受基因型和果型的影響較大，這與前人的研究結果一致[8，9]。陳曉等[6]的研究中，43個辣椒供體基因型中胚狀體誘導率為0～18%。Mitykó等[10]報道，辣椒基因型不同誘導率不同，最高可達到178.2%，最低只有1.0%，小果和和中果基因型的花粉植株誘導率較低或為0。Dolcet-Sanjuan等[11]的研究結果表明，隨辣椒果型逐漸變小，孤雄生殖的誘導能力逐漸降低。

表3 接種量對辣椒花藥出愈率和出胚率的影響

表4 基因型和接種量對愈傷組織繼代培養的影響

辣椒花藥培養的胚狀體誘導率差異大。本研究從6份基因型中篩選出3份適合花藥培養的基因型；但胚狀體誘導率均較低，與所報道的較高的誘導率懸殊很大[10]，后繼工作中尚需從培養基、激素、培養條件等方面進行優化，以提高出胚率。有學者認為辣椒植株小孢子雄核發生能力依賴于不同基因型的遺傳特異性可能與B型花粉粒的比例有關，B型花粉粒是具有雄性發育潛力的花粉，活體內B型花粉粒的頻率在不同品種的不同花藥間有差異，與花藥愈傷組織的誘導和植株的再生密切相關[12]，因此，需從分子生物學角度深入探討辣椒花藥培養中雄核發育和胚狀體形成的發育機理。

關于花藥接種密度的問題研究較少，本研究結果表明，接種密度影響辣椒花藥出愈率，但對出胚率幾乎無影響。這一結果與李春玲等[13]的研究結果不同，即增加花藥在培養基上的接種密度，能明顯提高甜椒胚狀體的誘導頻率。另外，本試驗中辣椒花藥培養易形成愈傷組織，但這些初代形成的愈傷組織在繼代培養中易褐化死亡，而且均不能在繼續培養的第一代中分化出胚狀體，對其是否在以后的多代培養中分化出胚狀體或不定芽還有待進一步研究。

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