偏最小二乘法結(jié)合流動注射化學(xué)發(fā)光法同時(shí)測定蘆丁和維生素C

曾華金，梁會麗，游 靜，李世君，睢國慧，屈凌波，3*

(1.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南鄭州 450001; 2.鄭州大學(xué)化學(xué)分子工程學(xué)院，河南鄭州 450001;3.河南工業(yè)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，河南鄭州 450001)

1 引 言

復(fù)方蘆丁片為衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)收載的品種，由蘆丁(Rutin，RT)和維生素 C(Ascorbic acid，AA)兩味藥組成，具有降低毛細(xì)管的異常通透性和脆性的作用，主要用于防治高血壓病的輔助治療。對復(fù)方蘆丁片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，部頒標(biāo)準(zhǔn)是先經(jīng)萃取分離，再用比色法和碘量法分別測定蘆丁和維生素C的含量，方法繁雜費(fèi)時(shí)[1]。近年來，隨著分析技術(shù)的迅速發(fā)展，建立了同時(shí)測定復(fù)方蘆丁片中這兩種組分含量的分析方法，如紫外-分光光主法[2]、小波變換可見分光光度法[3]、高效液相色譜法[4-5]、近紅外漫反射光譜法[6]、毛細(xì)管電泳法[7-10]等。然而，由于分析方法及藥品組分本身的特點(diǎn)，往往存在光譜重疊、靈敏度低、樣品前處理復(fù)雜、重復(fù)性較差等缺陷。因此，建立一種相對簡單可靠的測定蘆丁和維生素C的方法，對于復(fù)方蘆丁片的質(zhì)量控制具有非常重要的意義。

化學(xué)計(jì)量學(xué)是化學(xué)量測的基礎(chǔ)理論與方法學(xué)，在處理化學(xué)量測中的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)處理、信號解析與分辨、化學(xué)分類決策與預(yù)報(bào)等方面，解決了大量傳統(tǒng)的化學(xué)研究方法所難以解決的復(fù)雜化學(xué)問題。其中偏最小二乘法(Partial least squares，PLS)是最普遍使用的定量分析方法，該方法可有效地除去噪聲，提取光譜信息，解決光譜共線問題[11]，因而能有效地解決紫外分光光度法測定復(fù)方蘆丁片中兩種組分時(shí)的光譜重疊問題[12]。然而，該方法的靈敏度仍然較低，不能滿足藥品質(zhì)量檢測的要求。

流動注射化學(xué)發(fā)光法由于無需檢測光源、操作簡單、靈敏度高、線性范圍寬及儀器便宜等特點(diǎn)，深受分析工作者的青睞，目前已廣泛應(yīng)用于化學(xué)、食品、藥學(xué)等領(lǐng)域。基于偏最小二乘法與流動注射化學(xué)發(fā)光法的優(yōu)點(diǎn)，目前已建立了多種藥品的檢測的新方法[13-15]，但是針對檢測復(fù)方蘆丁片中蘆丁與維生素C的偏最小二乘法-流動注射化學(xué)發(fā)光法卻未見報(bào)道。在堿性條件下，蘆丁與維生素C對魯米諾-鐵氰化鉀發(fā)光體系具有明顯的抑制作用，但兩者峰值出現(xiàn)的時(shí)間存在明顯差異。基于這一特點(diǎn)，本文將最小二乘法與流動注射化學(xué)發(fā)光法結(jié)合，建立了同時(shí)測定蘆丁和維生素C的新方法。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 儀器與試劑

IFFM-E型流動注射化學(xué)發(fā)光分析儀(西安瑞邁儀器有限公司)。

魯米諾儲備液(1 mmol·L－1)的配置:稱取0.017 8 g魯米諾(購于 Alfa aesar，USA)，用 10 mmol·L－1的氫氧化鈉溶液溶解，并用 10 mol·L－1的氫氧化鈉定容于100 mL棕色的容量瓶中。放入4℃冰箱，避光保存，放置3 d待其穩(wěn)定后使用。

鐵氰化鉀儲備液(10 mmol·L－1)的配置:稱取0.329 g 鐵氰化鉀，用 0.1 mol·L－1的氫氧化鈉溶液溶解，并用0.1 mol·L－1的氫氧化鈉定容于100 mL棕色的容量瓶中，放入4℃冰箱，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

按圖1所示連接流動注射化學(xué)發(fā)光分析儀，分別將魯米諾溶液、空白溶液、鐵氰化鉀溶液以及氫氧化鈉溶液通過相應(yīng)的管道輸入分析系統(tǒng)，待基線穩(wěn)定后注入樣品溶液，記錄反應(yīng)的發(fā)光信號。將其中未加入樣品的體系所產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度定義為本體發(fā)光值I0，而將樣品加入到發(fā)光體系中所得到的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度定義為I，則降低的化學(xué)發(fā)光值ΔI=I0－I，以ΔI作為定量分析的依據(jù)。

圖1 流動注射化學(xué)發(fā)光儀的流程圖。Fig.1 Schematic diagram of the FI-CL system.

2.3 樣品處理

2.3.1 復(fù)方蘆丁片的處理

精密稱取10片復(fù)方蘆丁片并用研缽研磨成細(xì)粉，然后將細(xì)粉溶于少量 DMSO溶液中(V(DMSO)∶V(H2O)=1∶100)，隨后用雙蒸水定容至100 mL并過濾備用。

2.3.2 尿液的處理

于20.0 mL健康成人的尿液中加入不同量的樣品溶液，然后各加入50 μL濃度為0.1 mol·L－1的NaOH溶液和1.2 mL的乙酸乙脂，振蕩30 s后于12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心1 min，將乙酸乙脂層轉(zhuǎn)移至另一離心管中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于室溫吹干。殘留物溶于適量的蒸餾水中待測。

3 結(jié)果與討論

3.1 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的動力學(xué)曲線

我們用IFFM-E型化學(xué)發(fā)光分析儀的靜態(tài)測量系統(tǒng)研究了化學(xué)發(fā)光反應(yīng)動力學(xué)性質(zhì)。如圖2所示，當(dāng)蘆丁和維生素C分別加入到魯米諾-鐵氰化鉀化學(xué)發(fā)光體系后，兩種藥品能明顯降低該體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，但兩者峰值出現(xiàn)的時(shí)間卻有所差異，分別為5.8 s和6.4 s;而當(dāng)蘆丁和維生素C共同加入到該化學(xué)發(fā)光體系后，其化學(xué)發(fā)光的曲線及峰值出現(xiàn)的時(shí)間均發(fā)生了明顯的變化，峰值出現(xiàn)在5.6 s。這一結(jié)果表明，蘆丁和維生素C與Fe3+間的反應(yīng)速度存在明顯差異，因而偏最小二乘法適合用于復(fù)方蘆丁片中兩組分的同時(shí)測定。

圖2 化學(xué)發(fā)光動力學(xué)曲線。(a)4.0 μmol·L－1魯米諾溶液 +4 mmol·L－1鐵氰化鉀溶液;(b)4.0 μmol·L－1魯米諾溶液 +4 μmol·L－1鐵氰化鉀溶液 +0.06 mg·L－1蘆丁;(c)4.0 mmol·L－1魯米諾溶液 +4 mmol·L－1鐵氰化鉀溶液 +0.4 mg·L－1維生素 C;(d)4.0 μmol·L－1魯米諾溶液 +4 mmol·L－1鐵氰化鉀溶液 +0.4 mg·L－1維生素 C+0.06 mg·L－1蘆丁。Fig.2 CL signals for(a)4.0 μmol·L －1luminol+4 mmol·L －1K3Fe(CN)6，(b)4.0 μmol·L －1luminol+4 mmol·L－1K3Fe(CN)6+0.06 mg·L－1of RT，(c)4.0 μmol·L－1luminol+4 mmol·L－1K3Fe(CN)6+0.4 mg·L－1 AA，and(d)4.0 μmol·L－1luminol+4 mmol·L－1 K3Fe(CN)6+0.4 mg·L－1AA+0.06 mg·L－1RT.

表1 同時(shí)測定蘆丁和維生素C的最佳條件Table 1 The optimum conditions for simultaneous determination of AA and RT

3.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

為了獲得最佳的檢測靈敏度和最適合的信噪比，對實(shí)驗(yàn)流速、反應(yīng)介質(zhì)及各反應(yīng)溶液的最適濃度進(jìn)行了考察，結(jié)果如表1所示，表明當(dāng)主泵和副泵流速均為 3.5 mL·min－1、反應(yīng)介質(zhì)為 0.10 mol·L－1NaOH 溶液、魯米諾濃度為 4.0 μmol·L－1、鐵氰化鉀濃度為 4 mmol·L－1時(shí)，能獲得最佳的靈敏度，因而選定這些濃度作為測量的最佳濃度。

3.3 干擾實(shí)驗(yàn)

在上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，為了驗(yàn)證在實(shí)際檢測應(yīng)用中的可行性，以蘆丁質(zhì)量濃度為0.10 mg·L－1，維生素 C 質(zhì)量濃度為 1.00 mg·L－1作為標(biāo)準(zhǔn)，對藥品中可能存在輔料、陰陽離子及其它藥物進(jìn)行了考察，以相對誤差不大于±5%計(jì)算。結(jié)果表明:150倍的，200倍的 Glucose、Sucrose和 EDTA，80倍 Ca2+和 Ba2+，50倍的 Dextrin和 Urea，30倍的 Starch、Mg2+和DMSO 溶液 (V(DMSO)∶V(H2O)=1∶100)均不干擾測定。但Cu2+、dopamine和amoxicillin對實(shí)驗(yàn)的干擾較大。

3.4 單組分線性關(guān)系考察

在優(yōu)化條件下，對蘆丁和維生素C分別進(jìn)行了測定，結(jié)果表明，發(fā)光強(qiáng)度ΔI與蘆丁濃度和維生素C 濃度(c)在0.02 ～0.6 mg·L－1和0.1 ～20 mg·L－1范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其線性方程分別為ΔI=12660c+32.018(R2=0.999 8)和 ΔI=2098.7 c+88.12(R2=0.997 7)。根據(jù) IUPAC 建議，計(jì)算本方法的檢測限蘆丁和維生素C分別為4.5 μg·L－1和8.9 μg·L－1(信噪比為3)。對質(zhì)量濃度為0.1 mg·L－1的蘆丁和 1.0 mg·L－1的維生素 C溶液平行測定10次，得方法的相對偏差分別為2.80%和 1.42%。

3.5 PLS模型的建立

3.5.1 校正集的建立

采用正交實(shí)驗(yàn)方法，選擇L25(52)正交表設(shè)計(jì)校正集，選取蘆丁和維生素C的各5個(gè)濃度水平分別為 0.02，0.05，0.1，0.3，0.6 mg·L－1和 0.1，0.5，2.0，8.0，16.0 mg·L－1，共配制 25 組溶液，進(jìn)行分析測定。

3.5.2 主因子數(shù)的選擇

在PLS法中，主因子數(shù)會受到體系中被測物質(zhì)的交互作用和基體效應(yīng)以及噪聲的影響，故一般選用交互驗(yàn)證法得到的預(yù)測殘差平方和(PRESS)來確定主因子數(shù)[13]，得到噪聲最小的最佳主因子數(shù)。

根據(jù)F檢驗(yàn)，本體系的PRESS計(jì)算結(jié)果表明，最佳主因子數(shù)均為3時(shí)，PRESS達(dá)到極小值。

3.5.3 模型預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性與精密度考察

分別配制6組模擬樣品，其加入濃度組成及測定結(jié)果見表2。

將測得的值與建立的校正集結(jié)合，用PLS模型計(jì)算含量，以濃度計(jì)算值與濃度真實(shí)值進(jìn)行回歸分析，線性方程分別為 YRT=1.011XRT－0.0215(R2=0.999 8) 和 YAA=1.0434 XAA－ 0.0097(R2=0.994 5)。模型其它統(tǒng)計(jì)參數(shù):均方根誤差(Root mean square difference，RMSD)、相關(guān)系數(shù)(Square of the correlation coefficient，R2)及預(yù)測的相對誤差(Relative error of prediction，REP)可按下列公式[13]進(jìn)行計(jì)算。

表2 蘆丁和維生素C混合樣品的預(yù)測結(jié)果Table 2 Prediction results for the synthetic mixture of AA and RT

其中ci表示樣品的真實(shí)濃度i表示樣品的估計(jì)濃度i表示樣品真實(shí)濃度的平均值，n是樣品的總數(shù)。計(jì)算結(jié)果見表3，可見PLS模型具有良好的預(yù)測性能。

表3 PLS校正模型的統(tǒng)計(jì)參數(shù)Table 3 Statistical parameter of the optimization matrix using the PLS model

3.6 實(shí)際樣品分析

按2.3.1方法進(jìn)行樣品處理，將所得的樣品溶液用所建立的PLS模型處理，測定結(jié)果見表4。結(jié)果表明，用PLS模型測定復(fù)方蘆丁片中蘆丁與維生素C的含量與其標(biāo)示量十分吻合(復(fù)方蘆丁片中蘆丁標(biāo)示量為每片50 mg，維生素C的標(biāo)示量為每片20 mg)。

此外，該P(yáng)LS模型也應(yīng)用于人體尿液中蘆丁和維生素C含量的測定。由表5可看出，尿液中樣品回收率為96.3% ～104.0%，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.68% ～1.67%。與現(xiàn)有同時(shí)測定蘆丁和維生素C的分析方法比(表6)，該方法具有靈敏度高，分析速度快及操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，適合用于藥品及生物樣品等復(fù)雜體系中蘆丁與維生素的同時(shí)測定。

表4 復(fù)方蘆丁片中蘆丁和維生素C的測定結(jié)果Table 4 Determination of AA and RT in compound rutin Tablets

表5 人體尿液中蘆丁和維生素C的測定結(jié)果Table 5 Determination of AA and RT in human urine samples

表6 同時(shí)測定蘆丁和維生素C的分析方法的比較Table 6 Analytical methods for simultaneous determination of AA and RT

4 結(jié) 論

根據(jù)蘆丁和維生素C均對魯米諾-鐵氰化鉀化學(xué)發(fā)光體系具有顯著的抑制作用，但兩者峰值出現(xiàn)的時(shí)間存在明顯差異這一特點(diǎn)，將偏最小二乘法與流動注射化學(xué)發(fā)光法結(jié)合，建立了同時(shí)檢測復(fù)方蘆丁片和人體尿液中蘆丁與維生素C的新方法。該方法具有靈敏度高、分析速度快及操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，為藥品及生物復(fù)雜體系中蘆丁與維生素C的同時(shí)測定提供了可靠的實(shí)驗(yàn)方法。

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