蛹蟲草-山楂復合保健飲料的研制

林標聲，羅茂春*

(1.龍巖學院生命科學學院，福建 龍巖 364012；2.龍巖學院閩西食品研究所，福建 龍巖 364012；3.預防獸醫學與生物技術福建省高等學校重點實驗室，福建 龍巖 364012)

蛹蟲草(Cordyceps militaris)，又名北冬蟲夏草，是一種珍稀的藥用菌，與冬蟲夏草同屬異種[1-2]。蛹蟲草含有蟲草多糖、蟲草素、核苷類、甾醇類等營養成分和人體必需的氨基酸、維生素和過氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等多種生物活性物質[3-4]，在降血脂、防止動脈硬化、調整中樞神經功能、延長睡眠、抗炎、抗癌、抗菌、抗衰老[5]等方面都有良好功效，是一種良好的營養和滋補佳品。目前，國內外已有大量的人工栽培蛹蟲草，如固體栽培子實體和液體深層發酵培養菌絲體等，經檢測其活性成分和含量均與野生蛹蟲草相當[6-7]。人工栽培蛹蟲草的出現可為蛹蟲草保健食品的工業化生產提供充足的原料來源。

山楂(Crataegus pinnatifi da)，是薔薇科、蘋果亞科、山楂屬植物的果實，具有開胃消食、防治心血管疾病、平喘化痰、防衰老、抗癌、抑菌等作用[8]。山楂酸甜可口、營養豐富，幾乎含有水果的所有營養成分，特別是有機酸和維生素C的含量較高，因此山楂也非常適合于做特殊風味的飲料[9]。

據報道，蛹蟲草液體發酵中，70%以上的蟲草素、蟲草多糖、蟲草酸分布在發酵液中[10]，活性成分極其豐富。因此，本研究采用添加山楂于蛹蟲草液體發酵培養基中，進行蛹蟲草液體發酵培養，對發酵液進行風味調配，研制成具有保健功能和山楂酸甜口味的復合保健飲料，為蛹蟲草功能食品向多元化方向發展提供實驗依據，使其加工更精細、配方更科學、功能更明確、效果更顯著。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草菌株由龍巖學院微生物實驗室保藏；山楂、蔗糖、檸檬酸、糊精 市售。

蛹蟲草菌種培養基：土豆200g，蛋白胨5g，酵母膏5g，KH2PO41g，MgSO40.5g，瓊脂20.0g，自然pH值，水1000mL；蛹蟲草液體發酵基礎培養基：土豆200g，葡萄糖12g，玉米粉15g，蛋白胨5g，酵母膏5.7g，KH2PO41g，MgSO40.5g，pH6.4，水1000mL。

1.2 儀器與設備

ZHWY-2102雙層全溫度振蕩器 上海智誠分析儀器制造有限公司；VD-650型無菌操作臺 蘇州凈化設備有限公司；HHS-12 雙孔電熱恒溫水浴鍋 北京衡器公司。

1.3 方法

1.3.1 蛹蟲草菌種的活化、篩選

將本實驗室保藏的5株蛹蟲草菌種在菌種培養基上進行活化、傳代， 24℃培養6d，培養過程中定期對蛹蟲草菌株進行觀察并測定菌落直徑，挑選長勢優良、性能良好的菌株用于以下液體發酵培養。

1.3.2 山楂液體發酵培養基的制備

挑選新鮮無霉爛的山楂，經清水洗凈后切碎待用。在50mL蛹蟲草液體發酵基礎培養基分別添加5、8、11、14、17g山楂，混合均勻(山楂懸浮于培養液中，pH5.0～6.4)，以不添加山楂為對照，分別在雙層全溫度振蕩器進行搖瓶培養(24℃，150r/min，培養6d)，觀察蛹蟲草菌絲生長情況，并綜合考慮培養液的澄清度、顏色、氣味等因素，以發酵液呈淡棕紅色或淺咖啡色、澄清透明、有光澤、具有蛹蟲草和山楂獨特的甜香氣、無其他異味、無雜質及懸浮物、均勻一致為100分進行評價打分，確定蛹蟲草液體發酵培養基中最適的山楂添加量。

1.3.3 復合保健飲料研制的工藝流程及操作要點

操作要點：發酵：24℃，150r/min，培養6d；離心：4000r/min離心10min，取上清液；過濾：八層紗布過濾；均質：混合后的物料在20MPa的高壓均質機中均質，防止分層沉淀；滅菌：均質后的物料灌裝于玻璃瓶中，灌裝后真空封罐，真空度控制在360mm Hg以上，采用巴氏消毒。

1.3.4 復合保健飲料的評定標準

復合保健飲料殺菌后，立即由實驗室的10名同學對其進行感官評分，每次評分前用溫開水漱口。評定標準如表1所示，綜合感官評價分值/分＝20%×外觀形態評分＋20%×色澤評分＋20%×風味評分＋40%×口感評分[11-12]。

表 1 復合保健飲料的評定標準Table 1 Standards for assessment of compounded health beverage

1.3.5 復合保健飲料調配工藝的優化

1.3.5.1 復合保健飲料調配的單因素試驗

1) 蛹蟲草發酵醪液添加量：蛹蟲草本身具有特殊的清香微苦的味道，復合飲料中含發酵液過多或過少，都會影響飲料的口感[13]。

選定復合飲料中分別添加體積分數為40%、50%、60%、70%、80%的發酵醪液，考察復合飲料的綜合感官評價，確定較適的發酵醪液用量。

2) 蔗糖添加量：分別在復合飲料中添加4、5、6、7、8g/100mL的蔗糖調節口感，考察復合飲料的綜合感官評價，確定較適的蔗糖用量。

3) 檸檬酸添加量：分別在復合飲料中添加0.04、0.06、0.08、0.1、0.12g/100mL的檸檬酸作為調味劑，考察復合飲料的綜合感官評價，確定較適的檸檬酸用量。

4) 穩定劑添加量：β-環狀糊精是一種良好的穩定劑和矯味劑，能包絡各種化合物分子，增加被包絡物對光熱、氧的穩定性，在食品制造方面主要用來消除異味，提高香料香精以及色素的穩定性，增強乳化能力和防潮能力。單純的發酵濾液不僅口感不夠豐滿，而且飲料本身也不夠穩定，添加穩定劑糊精可以改善口感和飲品的穩定性[14]，能夠更長時間的保存。因此，本研究分別在復合飲料中添加0.05、0.10、0.15、0.20、0.25g/100mL的糊精作為穩定劑，考察復合飲料的綜合感官評價，確定較適的穩定劑糊精用量。

各組單因素試驗重復3次，取平均值，分析各組差異。

1.3.5.2 響應面法優化復合保健飲料中各因素的調配

在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken試驗設計原理，采用響應面分析法，以產品感官品質作為評價指標，利用Design-Expert 軟件在4因素3水平上對復合保健飲料調配的蛹蟲草發酵醪液用量、蔗糖添加量、檸檬酸添加量、穩定劑添加量進行優化，確定最適的復合保健飲料調配方案。

1.3.6 復合保健飲料的產品鑒定和保質期試驗

對所研制的復合保健飲料從外觀、口感、微生物指標、保質期等方面進行檢測，保證產品符合食品安全生產要求[15-16]。

2 結果與分析

2.1 山楂液體發酵培養基的制備

山楂液體發酵培養基的制備結果如圖1所示。菌絲體干質量的測定方法為取100mL的發酵液，離心取菌絲體，60℃恒溫干燥，稱量[17]。

圖 1 山楂添加量液體發酵培養基制備結果Fig.1 Results of preparation of liquid culture medium with different additive amounts of hawthorn

由圖1可知，添加山楂后菌絲體質量均大于未添加山楂的菌絲體質量，表明添加山楂后，蛹蟲草菌株生長得更好；綜合菌體生長情況和發酵液綜合評分情況，山楂添加量為11g/50mL時，其菌體質量最大、綜合評分最高，因此確定蛹蟲草液體發酵培養基中最適的山楂添加量為11g/50mL。

2.2 復合保健飲料調配的單因素試驗

2.2.1 蛹蟲草發酵醪液添加量

圖 2 發酵醪液添加量對復合飲料綜合感官評價的影響Fig.2 Effect of fermented liquid usage on the comprehensive sensory score of composite healthy beverage

如圖2所示，發酵醪液添加量為60%、70%和80%時，復合飲料的綜合感官評價值較高，因此選定該3個數值作為響應面法優化的因素水平。

2.2.2 蔗糖添加量

圖 3 蔗糖添加量對復合飲料綜合感官評價的影響Fig.3 Effect of sucrose usage on the comprehensive sensory score of composite healthy beverage

如圖3所示，蔗糖添加量為5、6、7g/100mL時，復合飲料的綜合感官評價值較高，因此選定該3個數值作為響應面法優化的因素水平。

2.2.3 檸檬酸添加量

圖 4 檸檬酸添加量對復合飲料綜合感官評價的影響Fig.4 Effect of citric acid usage on the comprehensive sensory score of composite healthy beverage

如圖4 所示，檸檬酸添加量為0.0 8、0.1 0、0.12g/100mL時，復合飲料的綜合感官評價值較高，因此選定該3個數值作為響應面法優化的因素水平。

2.2.4 穩定劑添加量

圖 5 穩定劑添加量對復合飲料綜合感官評價的影響Fig.5 Effect of stabilizing agent usage on the comprehensive sensory score of composite healthy beverage

如圖5所示，穩定劑β-環狀糊精添加量為0.10、0.15、0.20g/100mL時，復合飲料綜合感官評價值較高，因此選定該3個數值作為響應面法優化的因素水平。

2.3 響應面法優化復合保健飲料中各因素的調配

表 2 Box-Behnken設計因素與水平編碼表Table 2 Coded values of Box-Behnken design

表 3 Box-Behnken試驗設計與結果Table 3 Experimental design and results

表 4 回歸模型的方差分析結果Table 4 Results of analysis of variance of regression model

以綜合感官評價為指標進行Box-Behnken設計，4因素3水平的響應面設計如表2所示，試驗結果如表3所示。利用Design-Expert 7.0 軟件對試驗數據進行回歸分析，得到復合保健飲料綜合評分和各因素變量之間的二元回歸方程為：Y= 94.86000＋3.55000A＋1.59167B＋2.55833C＋0.11667D－0.02500AB＋1.20000AC＋2.12500AD－1.72500BC－1.27500BD－0.15000CD－4.89667A2－4.03417B2－2.45917C2－7.79667D2。

對回歸模型進行方程分析，結果如表4所示。該模型具有統計學意義(P=0.0001＜0.05)，失擬項不顯著(P=0.2347＞0.05)，表明回歸方程擬合情況好，誤差小，能較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，可以利用該方程確定復合保健飲料中各因素的最適調配比例。從各因素方差分析結果可知，對復合保健飲料綜合感官評分影響大小的順序依次為發酵醪液添加量(A)＞檸檬酸添加量(C)＞蔗糖添加量(B)＞穩定劑添加量(D)，其中發酵醪液用量(A)和檸檬酸添加量(C)對響應值結果影響極其顯著，蔗糖添加量(B)對響應值結果影響顯著，穩定劑添加量(D)對響應值結果影響不顯著。

2.4 響應面試驗

圖 6 復合保健飲料調配各因素交互作用響應曲面圖Fig.6 Response surface showing the interactions of formulation parameters on the comprehensive sensory score of composite healthy beverage

如圖6所示，根據所得模型可預測復合保健飲料中各因素的最優調配工藝條件為發酵醪液添加量74.49%、蔗糖添加量6.06g/100mL、檸檬酸添加量0.11g/100mL，穩定劑添加量0.15g/100mL，在該條件下復合保健飲料的綜合評分能達到97.4843分。

2.5 工藝條件優化條件下的模型驗證

分別按上述的最優工藝條件進行3次平行實驗，所得的蛹蟲草復合保健飲料的綜合評分均值為97.38分，與理論預測值97.4843分接近，重復性較好，說明響應面優化所得的工藝條件參數準確、可靠、可行。

2.6 復合保健飲料的產品鑒定和保質期試驗

對所研制的復合保健飲料從外觀、口感、微生物指標等方面進行檢測，結果表明：飲料外觀均勻一致，呈淡棕紅色或淺咖啡色，澄清透明，有光澤；組織狀態均勻穩定，無分層、沉淀現象，無雜質及其懸浮物；口感香甜爽口，具有濃郁清的蛹蟲草和山楂獨特的甜香氣，回味愉快，無其他異味。微生物學檢驗表明：細菌總數≤100個/mL，大腸桿菌≤3個/100mL，無致病菌檢出。

將產品分別置于5、25、37℃的恒溫培養箱中培養，質量衛生指標每周檢測一次，1個月質量各項指標穩定，保質期能達到1年。

3 結 論

本實驗初步具有山楂風味的蛹蟲草復合保健飲料的研制，通過響應面分析法優化其加工工藝各調配參數比例，結果表明：在50mL蛹蟲草液體發酵基礎培養基分別添加11g山楂制備成發酵液，接種優良的蛹蟲草菌種進行液體發酵，取發酵液，按發酵醪液添加量74.49%、蔗糖添加量6.06g/100mL、檸檬酸添加量0.11g/100mL、穩定劑添加量0.15g/100mL 進行調配制備復合保健飲料，經檢驗，該條件下復合保健飲料外觀形態、色澤、口感等均為最佳，綜合評分最高，且符合國家食品生產衛生標準。

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