氫化物發生-原子熒光法測定鴨蛋中無機硒和有機硒

王世成，王顏紅,*，劉艷輝，崔杰華，張 紅，齊 偉，李林平

(1.中國科學院沈陽應用生態研究所，遼寧 沈陽 110016；2.中國綠色食品發展中心，北京 100081)

硒是人體必需的微量元素，具有抗氧化和增強免疫力的生物學功能[1]，對人體健康有著極為重要的意義。研究[2-4]表明，無機硒毒性大，生物活性低；而有機硒毒性小，吸收率高，生物利用率高，因此，有機硒產品的研制是當前的研究熱點之一，其中富含有機硒的鴨蛋是常用的補硒產品之一，愈來愈受到重視。目前，在我國市場上已經有富硒鴨蛋銷售，但是，由于缺乏有效的有機硒測試方法，使得富硒鴨蛋的質量難以有效的控制。

目前，總硒的測定方法有分光光度法[5]、原子吸收光譜法[6]、電感耦合等離子體發射光譜法[7]、氫化物-發生原子熒光光譜法[8]等等。對于樣品中有機硒的測定，有文獻報道采用分光光度法測定富硒酵母中有機硒的含量[9]；采用氫化物發生-原子熒光光譜法測定富硒酵母中有機硒和無機硒[10]；采用順序注射氫化物發生原子熒光法測定農產品中的無機硒和有機硒[11]；采用液相色譜-質譜聯用方法測定硒蛋氨酸的方法[12]等。上述文獻的測試方法大多是針對植物、微生物產品，而動物性食品中有機硒總量的測定方法還未見報道。對于鴨蛋中總硒的測定，有文獻報道了分光光度法測定富硒蛋粉中總硒含量的方法[13]和氫化物原子熒光光譜法測定雞蛋中總硒含量方法[14]。有文獻報道采用高效液相色譜-等離子體質譜聯用技術分析富硒雞蛋中兩種硒代氨基酸[15]，但該方法對儀器和技術要求較高，不適宜普遍推廣應用。為此，在能夠測定鴨蛋總硒的前提下，本方法采用三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖溶液提取，硫酸銨沉淀的方法，有效分離鴨蛋樣品中的無機硒和有機硒，采用原子熒光法測定其中的總硒和無機硒，應用差減法計算有機硒的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普通鴨蛋和富硒鴨蛋均采自遼寧省大連某蛋鴨養殖企業。

硝酸、高氯酸、鹽酸均為優級純；pH8.6的Tris-HCl緩沖溶液：稱取1.211g三羥甲基氨基甲烷，0.404g MgCl2·6H2O，用80mL水將其溶解，用6mol/L鹽酸調節pH值至8.6，用去離子水定容至100mL。NaBH4(20g/L)和NaOH(4g/L)的混合溶液：分別稱取6g NaBH4和1.2g NaOH，加入300mL去離子水將其溶解并定容，現用現配；鐵氰化鉀溶液(100g/L)：稱取10.0g鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)溶于100mL水中，混勻；硒標準儲備溶液：1000mg/L。硒標準應用液：取1000mg/L硒標準儲備液逐級稀釋，分別得到質量濃度為500μg/L和100μg/L的溶液。

1.2 儀器與設備

AFS-2202E型原子熒光光譜儀(配有硒空心陰極燈) 北京海光儀器公司；KQ-250B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；KGB-2型電熱板 沈陽市森華理化儀器研究所；TDL-40C型離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 總硒的測定

按GB/T 5009.93—2003《食品中硒的測定》方法測定。

1.3.2 無機硒的測定

1.3.2.1 無機硒的提取

稱取混合均勻的鴨蛋樣品1g(精確到0.001g)，加入Tris-HCl緩沖溶液(pH8.6)10mL，超聲提取2h；4000r/min離心10min，移出上清液，加入6g硫酸銨，混勻，靜置10min，以4000r/min離心10min，移出清液；殘渣中再加入0.6g硫酸銨，同時加入1mL Tris-HCl緩沖溶液潤洗后，離心，合并清液。同時做空白實驗。

1.3.2.2 提取液的消解

吸取離心后的提取清液(1.3.2.1節)，加入10mL混酸(硝酸：鹽酸(4：1，V/V))，加熱消解，并及時補加混酸，待溶液變為澄清無色并伴有白煙時，繼續加熱至剩余量為1～2mL時；再加入5mL鹽酸溶液(6mol/L)，繼續加熱至清亮無色并伴有白煙出現，冷卻，轉移至25mL容量瓶中，加入鹽酸5.0mL、鐵氰化鉀溶液2.5mL，用去離子水定容至刻度，混勻待測。

1.3.2.3 標準曲線的配制

取50mL容量瓶6支，依次準確加入100μg/L硒標準使用液0、1.0、2.5、5.0mL和500μg/L的硒標準使用液2.0、5.0mL，分別加入鹽酸10.0mL、鐵氰化鉀溶液(100g/L)5.0mL，用去離子水定容至刻度(各相當于硒質量濃度0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0μg/L)，混勻待測。

1.3.2.4 儀器測定條件

原子化器高度：8mm；燈電流：80mA；載氣流量：400mL/min；屏蔽氣流量：1000mL/min；原子化溫度：800℃；光電倍增管負高壓：300V；延遲時間：1s；讀數時間：12s；進樣體積：1mL。

1.3.2.5 測定

在測定標準系列溶液后，分別吸取空白溶液和試樣溶液進行測定。

1.3.3 有機硒總硒的含量減去無機硒的含量即得有機硒含量。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

配制硒質量濃度為2.0～50μg/L的標準溶液，按建立的方法，以硒質量濃度(μg/L)為橫坐標，熒光強度為縱坐標，繪制標準曲線y=32.378x－50.631，R2=0.9999，測定質量濃度在2.0～50μg/L線性關系良好，適用于樣品的測定分析。

2.2 提取劑的選擇

鴨蛋中的硒主要以蛋白的結合形式存在，Tris-HCl緩沖溶液可作為蛋白的理想提取試劑，因此采用該溶液作為鴨蛋中的有機硒和無機硒提取劑。參考文獻[7]考察在提取液中加入甘油增加提取效果，結果發現提取劑中添加一定量的甘油，在消解的過程中，容易產生過熱的迸濺現象影響結果的平行性，沒有添加甘油的測試結果平行性較好。故采用不含甘油的pH8.6的Tris-HCl緩沖溶液提取，以利于減少樣品在消解過程中的損失。

2.3 沉淀劑的選擇

表 1 不同沉淀劑的效果Table 1 Effect of different precipitant on the recovery of selenium

采用溶劑提取獲得有機硒和無機硒溶液后，通過沉淀蛋白的方式去除有機硒，比較采用硫酸銨和無水乙醇作為沉淀劑沉淀蛋白的效果。稱取1g樣品，加入一定量的硒標準溶液，加入10mL的pH8.6 Tris-HCl緩沖溶液，超聲提取2h，再分別加入0.6g硫酸銨固體和15mL無水乙醇沉淀蛋白，以4000r/min離心10min，上清液定容至25mL，按建立的方法消解分析，結果見表1。結果表明，無水乙醇做沉淀劑有利于溶液和沉淀的分離，但測得的加標回收率偏低。用硫酸銨固體作沉淀劑回收率較高，雖然溶液和沉淀不容易分離，但可通過高速離心和增加離心時間實現。故采用硫酸銨作為蛋白沉淀劑。

2.4 精密度實驗和方法的檢出限

方法精密度：樣品中添加無機硒標準溶液，添加量為0.4mg/kg、按照本方法確定的條件進行重復性實驗，其相對標準偏差RSD≤5%。說明本方法用于測定鴨蛋中無機硒的含量有較好的精密度。

表 2 方法的精密度(n=5)Table 2 Precision test (n=5)

根據限量檢測要求，連續11次測量樣品空白對照液，按3倍標準偏差計算其檢出限(3σ)為0.09μg/L，按稱樣1g計算，定容25mL計算，無機硒的檢出限為0.003mg/kg。

2.5 回收率實驗

以普通鴨蛋為樣品，分別添加0.4、1.0mg/kg和2.0mg/kg的硒標準溶液，按建立的方法，測定了無機硒的回收率，每個樣品做3個平行，結果見表3。結果表明，3種加標量的無機硒添加回收率在82.8%～91.0%之間，基本滿足樣品測定的需求，通過差減法得到的樣品的有機硒含量是真實可信的。

表 3 無機硒的回收率Table 3 Recoveries of inorganic selenium

2.6 樣品中有機硒的測定

表 4 樣品中有機硒和無機硒的測定 Table 4 Determination of organic selenium and inorganic selenium in samples

按照建立的方法，測定了3批富硒鴨蛋樣品中無機硒和有機硒含量，結果見表4。結果表明，富硒鴨蛋中的有機硒占總硒的95.2%和95.9%，無機硒占總量的4.8%和4.1%，無機硒的測定結果與Lipiec等[15]分析結果基本相符。Lipiec分析富硒雞蛋中的硒蛋氨酸和硒半胱氨酸，二者的總和占總硒的75%，無機硒占總量的6.4%，說明兩種硒代氨基酸的含量只代表了大部分有機硒但并不是全部。

3 結 論

建立了鴨蛋中有機硒和無機硒的測定方法，采用Tris-HCl緩沖溶液提取，硫酸銨沉淀，原子熒光法測定其中的總硒和無機硒，采用差減法計算有機硒的含量，方法靈敏度高，線性范圍，精密度以及加標回收率均獲得滿意結果。為鴨蛋中有機硒和無機硒的測定提供了一種完善檢測方法。

[1] ABDULAH R, MIYAZAKI K, NAKAZAWA M, et al. Chemical forms of selenium for cancer prevention[J]. J Trace Elem Med Bio, 2005, 19(2)： 141-150.

[2] RAYMA M P. The use of high-selenium yeast to raise selenium status： how does it measure up?[J]. Brit J Nutr, 2004, 92(4)： 557-573.

[3] MCKENZIE M J, HUNTER D A, PATHIRANA R, et al. Accumulation of an organic anticancer selenium compound in atransgenic Solanaceous species shows wider applicability of the selenocysteine methyltransferase transgene from selenium hyperaccumulators[J]. Transgenic Res, 2009, 18(3)： 407-424.

[4] MIGUEL N A, CARMEN C V. Selenium in food and the human body： a review[J]. Sci Total Environ, 2008, 4009(1)： 115-141.

[5] 劉有芹, 楊慶輝, 黃函, 等. 紫外分光光度法測定枸杞子、陳皮、生姜中硒含量[J]. 理化檢驗： 化學分冊, 2010, 46(3)： 329-330.

[6] 楊瀟, 芮光偉, 許海東. 微波消解-石墨爐原子吸收光譜法檢測大米中硒元素的含量[J]. 食品與發酵工業, 2010, 36(1)： 138-141.

[7] 于振花, 荊淼, 黃彥良, 等. 微波消解-電感耦合等離子體質譜測定食品中硒的含量[J]. 食品研究與開發, 2009, 30(10)： 100-103.

[8] 肖輝, 吳向陽, 仰榴青, 等. 氫化物-原子熒光法測定姬松茸子實體中硒含量[J]. 食品科學, 2010, 31(10)： 247-249.

[9] 郝素娥, 滕冰. 硒酵母中有機硒及硒代氨基酸含量的測定方法[J]. 分析測試學報, 1999, 18(3)： 72-74.

[10] 高建忠, 秦順義, 黃克和. 氫化物發生-原子熒光光譜法測定富硒酵母中的有機硒和無機硒[J]. 分析科學學報, 2006, 22(2)： 157-160.

[11] 崔海容, 陳建華, 谷家越, 等. 順序注射HG-AFS法測定富硒農產品中無機硒和有機硒[J]. 分析科學學報, 2005, 21(5)： 545-548.

[12] 楊文婕, 張明, 陳競, 等. LC-MS-MS同時定量檢測硒蛋氨酸和硒胱氨酸[J].中國食品衛生雜志, 2008, 20(3)： 204-207.

[13] 金松子, 蔡振華, 蔣慶峰. 分光光度法測定富硒蛋粉中的硒含量[J]. 現代食品與藥品雜志, 2007, 17(1)： 37-39.

[14] 郝莉鵬, 詹銘, 鄭嶸, 等. 上海市售雞蛋硒含量測定[J]. 實用預防醫學, 2003, 10(1)： 99-100.

[15] LIPIEC E, SIARA G, BIERLA K, et al. Determination of selenomethionine, selenocysteine and inorganic selenium in eggs by HPLC-inductively coupled plasma mass spectrometry[J]. Anal Bioanal Chem, 2010, 397(2)： 731-741.