傳統(tǒng)分離培養(yǎng)結(jié)合PCR-DGGE技術(shù)分析廣式臘腸中優(yōu)勢菌

謝 科，余曉峰，鄭海松，宗 凱，連英琪，劉國慶,*

(1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.安徽出入境檢疫檢驗局，安徽 合肥 230022)

廣式臘腸是中國傳統(tǒng)特色食品之一，具有外形美觀、色澤明亮、香味醇厚、鮮味可口、皮薄肉嫩的特點，備受國人喜愛。目前，市售廣式臘腸仍處于作坊式的生產(chǎn)階段，主要靠原料肉自身的微生物與環(huán)境微生物的競爭作用完成其發(fā)酵過程，屬于自然發(fā)酵[1]。而其在肉制品產(chǎn)業(yè)發(fā)達的國家，已經(jīng)完成了從傳統(tǒng)的自然發(fā)酵向微生物定向接種發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)變。微生物定向接種發(fā)酵具有發(fā)酵啟動快、發(fā)酵時間短、低值等優(yōu)點，極大地改善了肉制品的感觀品質(zhì)，提高了食品的安全性[2]。因此分離篩選廣式臘腸中的主要微生物，構(gòu)建具有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的微生物發(fā)酵劑，對廣式臘腸的生產(chǎn)和發(fā)展具有重要意義。目前對傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的研究主要還是應(yīng)用傳統(tǒng)的分離﹑純化﹑鑒定方法，需要進行一系列繁雜的形態(tài)特征和生理生化試驗，這種方法最大的缺點是即使使用最復(fù)雜的試驗組合也不能對分離物進行精確鑒定，不能反映分離物間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，不能獲得微生物多樣性的真正概貌[3-4]。1993年，Muzyer等[5]首次將變性梯度凝膠電泳法(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)技術(shù)應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)研究，并證實了這種技術(shù)在研究自然界微生物群落的遺傳多樣性和種群差異方面具有明顯的優(yōu)越性。DGGE能有效分析復(fù)雜微生物群落及其多樣性，且無需培養(yǎng)微生物，既可以用于傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品中微生物的種群結(jié)構(gòu)分析，也可以用來對分離出的純菌株進行分組和篩選，減少分子或生化鑒定的數(shù)量，具有快速可靠的特點[6]。Fontana等[7]利用PCR-DGGE技術(shù)對兩種手工阿根廷發(fā)酵干香腸發(fā)酵過程進行監(jiān)控和調(diào)查優(yōu)勢細菌群落，發(fā)現(xiàn)這種技術(shù)能夠區(qū)分乳酸菌和革蘭氏陽性凝固酶陰性球菌，是一種有效的確定手工發(fā)酵干香腸優(yōu)勢微生物菌群的方法。目前對廣式臘腸微生物的研究主要集中在微生物分布及作用機理了解等方面，而通過傳統(tǒng)分離方法從廣式臘腸中分離出某一個菌株或幾個菌株，系統(tǒng)全面地分析廣式臘腸微生物群落結(jié)構(gòu)的研究尚未有報道。本實驗采用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)與PCR-DGGE指紋技術(shù)相結(jié)合的方法對廣式臘腸微生物進行全面系統(tǒng)研究，分析其微生物群落結(jié)構(gòu)組成，從而篩選出其中的優(yōu)勢菌，以期為廣式臘腸發(fā)酵劑的開發(fā)研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

皇上皇廣式臘腸購自廣州越秀區(qū)東川路皇上皇臘味店。

PCA、MRS瓊脂 青島海博生物技術(shù)有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；Taq DNA聚合酶、2000bp DNA Marker、引物合成 大連寶生物工程公司；聚丙烯酰胺、尿素、去離子甲酰胺 西班牙Sigma公司；GelRed核酸凝膠染色劑 美國Biotium公司；DNA測序 上海生工生物工程公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-40AI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；DH5000AB型電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津泰斯特儀器有限公司；高速冷凍離心機 德國Beckman公司；DGGE電泳分析系統(tǒng) 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；PCR儀 美國AB公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌的分離和鑒定

在無菌條件下稱取25g廣式臘腸樣品，剪碎后加入225mL滅菌生理鹽水(含1g/L蛋白胨、9g/L NaCl)搖床振蕩培養(yǎng)30min。取1mL上清液依次進行10倍梯度稀釋，選擇合適的稀釋度涂布于不同的培養(yǎng)基中。MSA、MRS培養(yǎng)基分別于30℃和37℃培養(yǎng)48h后挑選特征性菌落，在分離培養(yǎng)基上多次劃線分離純化，最后對所得菌株根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》第九版[8]及《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9]對所得的優(yōu)勢菌群進行形態(tài)和生理生化測定。

1.3.2 細菌DNA提取

無菌條件下稱取廣式臘腸10g，剪碎加入50mL滅菌生理鹽水，搖床振蕩培養(yǎng)30min。4℃條件下500r/min離心10min，取上清液于4℃條件下12000r/min離心15min，棄上清液，將沉淀置于1.5mL離心管，應(yīng)用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌總DNA。分離純化得到的菌株先將其接種到50mL生理鹽水中，振蕩培養(yǎng)30min。按上述方法分別提取其DNA，將所提取DNA溶于TE緩沖液，－20℃條件下貯藏。

1.3.3 PCR擴增

采用細菌通用引物F357和R518對細菌16S rDNA的V3可變區(qū)進行PCR擴增。上游引物為帶GC夾的F357：GC-F357(5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCG GGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)；下游引物為R518(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)[10]。PCR反應(yīng)體系：10×Ex Taq Buffer 2.5μL，dNTP(2.5mmol/L)2μL，MgCl2(25mmol/L)2μL，Ex Taq DNA聚合酶(5U/μL，TaKaRa)0.25μL，模板DNA 2μL，上下游引物各1μL，補充ddH2O 14.25μL至終體積25μL。DNA擴增采用降落PCR，反應(yīng)程序見參考文獻[6]。取5μL PCR產(chǎn)物，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測含量及特異性后置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 DGGE分析

PCR產(chǎn)物的DGGE分析在DGGE電泳分析系統(tǒng)上進行。參照Tatsadjieu等[11]的方法進行，電泳條件：質(zhì)量分數(shù)8%的聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺：甲叉雙丙烯酰胺= 37.5：1)，變性梯度從30%到50%(100%變性劑含有7mol/L尿素和40%去離子甲酰胺)，PCR產(chǎn)物上樣量20μL，電泳溫度恒定60℃，在1×TAE緩沖液中先200V預(yù)電泳10min，然后在80V的固定電壓下電泳8h，采用GelRed核酸凝膠染色劑在1×TAE緩沖液中染色15min后，用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照保存，圖像分析用Quantity one分析軟件進行分析。

1.3.5 DNA的回收測序

在紫外燈下切下DGGE膠泳道中的主要亮帶，條帶按序分別放入標號的1.5 m L E P 管中，搗碎后加入3 0 μ L 滅菌d d H2O，－2 0 ℃條件下浸泡過夜，離心，取上清液作為模板進行P C R 擴增。引物為F357(5′-ACTCCTAC GGGAGGCAGCAG-3′)和R518(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)。擴增程序：94℃預(yù)變性4min，30個循環(huán)(94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s)，最終72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗產(chǎn)量及特異性后測序。登陸NCBI，將所得序列與數(shù)據(jù)庫中已知序列進行比較，用Clustal X和MEGA進行相似性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 可培養(yǎng)優(yōu)勢菌的分離和鑒定

用MSA、MRS培養(yǎng)基從廣式臘腸中分離出葡萄球菌19株，乳酸菌12株。對19株球菌進行形態(tài)學(xué)觀察，參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》對菌株進行生理生化試驗、糖醇發(fā)酵試驗、凝固酶反應(yīng)等，最后篩選得到4株葡萄球菌，分別標號為P1～P4。對分離得到12株乳酸菌進行耐鹽試驗、耐亞硝鹽試驗、接觸酶活性試驗、氨基酸脫羧酶活性試驗、硝酸鹽還原酶活性試驗、產(chǎn)氨試驗、產(chǎn)硫化氫試驗、產(chǎn)氣試驗、產(chǎn)粘液試驗等生理生化試驗鑒定，最終有2株乳酸菌屬于不同種屬，標號為L1、L2。

2.2 細菌16S rDNA的V3可變區(qū)的PCR擴增結(jié)果

將所提取的廣式臘腸混合菌群總DNA和各純化菌株DNA用16S rDNA的V3區(qū)引物(帶GC夾)進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳檢測，獲得約200bp左右的特異性擴增條帶，見圖1。擴增產(chǎn)物大小符合目的片段要求，且條帶清晰，適合進行下步DGGE電泳。

圖 1 細菌16S rDNA的V3區(qū)的PCR擴增電泳圖Fig.1 PCR amplification pattern of bacterial 16S rDNA from V3 region

2.3 廣式臘腸混合菌群和分離純菌株的PCR-DGGE指紋圖譜分析

如圖2所示，廣式臘腸混合菌群樣(泳道1)在DGGE電泳圖譜上顯示出7條可鑒別的條帶，分別為A、B、C、d、e、f、g。DGGE 圖譜上不同條帶代表不同的微生物種類，條帶的亮度代表微生物的數(shù)量，條帶越亮則微生物的數(shù)量越多[5]，即A、B、C條帶所代表的菌株為廣式臘腸中的主要優(yōu)勢菌，d、e、f、g條帶所代表的菌株為廣式臘腸中的次要優(yōu)勢菌。傳統(tǒng)方法分離純化所得的菌株(泳道2～7)DGGE電泳圖譜顯示，2、5號泳道條帶與混合菌群中的條帶C在同一位置，3號泳道條帶與d條帶在同一位置，4號泳道條帶H與混合菌群樣中條帶無對應(yīng)，6號泳道條帶與g條帶位置一致，7號泳道條帶與B位置一致。2、5號泳道條帶出現(xiàn)在同一位置，表明兩者可能為同一菌株。4、6、7號泳道出現(xiàn)多條雜帶，表明PCR產(chǎn)物不純，可能為PCR擴增中出現(xiàn)的引物二聚體或小片段產(chǎn)物。

圖 2 廣式臘腸中混合菌群和分離純菌株P(guān)CR-DGGE指紋圖譜Fig.2 PCR-DGGE analysis of 16S rDNA fragments from microbial community (1) and isolated bacteria (2-7) in Cantonese sausages

2.4 細菌16S rDNA的測序及序列分析

表 1 DGGE圖譜優(yōu)勢條帶序列比對結(jié)果Table 1 Tentative identification of predominant bacteria from DGGE bands by sequencing

對圖2中標記的較明顯的條帶進行割膠回收、測序，將所得序列與數(shù)據(jù)庫中已知序列進行比較，用Clustal X和MEGA進行相似性分析，見圖3，測序結(jié)果如表1所示。通過序列比對和相似性分析，條帶A、B、C、d、e、f、g、H代表的菌種分別為：腐生葡萄球菌、乳桿菌屬、木糖葡萄球菌、孔氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、芽孢桿菌屬、格氏乳球菌、阿爾萊特葡萄球菌。傳統(tǒng)分離方法所得菌株分別為木糖葡萄球菌(P1、P4)、孔氏葡萄球菌(P2)、阿爾萊特葡萄球菌(P3)、格氏乳球菌(L1)、乳桿菌屬(L2)。

圖 3 DGGE條帶序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中相關(guān)序列的相似性分析Fig.3 Similarity analysis of sequences derived from DGGE bands and relative sequences from GenBank

3 討 論

3.1 本研究將常規(guī)的分離技術(shù)與PCR-DGGE指紋圖譜技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用于廣式臘腸中優(yōu)勢細菌的篩選，結(jié)果顯示用PCR-DGGE方法直接從廣式臘腸中獲得的細菌群落結(jié)構(gòu)與用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)獲得的有一定的差異。條帶A、e、f均未在分離菌中條帶出現(xiàn)，這說明PCR-DGGE方法能夠克服傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法的不足，更能直觀地反映出廣式臘腸中細菌的組成。分離菌中有兩個條帶出現(xiàn)在同一位置，經(jīng)測序為同一菌株，這表明傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法不夠準確，存在一定的缺陷。分離菌中條帶H未在混合菌群條帶中出現(xiàn)，Heuer等[12]報道了在PCR過程中群落結(jié)構(gòu)中相對豐富的菌株由于競爭作用會影響某些菌株的擴增，也可能是因為該群落細菌數(shù)量太少，用常規(guī)的DNA提取方法可能提不到或提到微量的DNA，這會影響其PCR擴增，從而使得條帶H在混合菌群泳道條帶中表現(xiàn)不出來。

3.2 本實驗將PCR-DGGE指紋圖譜技術(shù)應(yīng)用于廣式臘腸中微生物群落結(jié)構(gòu)研究，通過PCR-DGGE指紋圖譜技術(shù)分析確定的主要優(yōu)勢菌為腐生葡萄球菌、乳桿菌屬、木糖葡萄球菌，次要優(yōu)勢菌為孔氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、芽孢桿菌屬、格氏乳球菌。傳統(tǒng)分離培養(yǎng)試驗從廣式臘腸中得到3株葡萄球菌、2株乳酸菌，分別為木糖葡萄球菌、孔氏葡萄球菌、阿爾萊特葡萄球菌、格氏乳球菌、乳桿菌屬。實驗分析結(jié)果顯示廣式臘腸中微生物群落有3類，乳酸菌、葡萄球菌和芽孢桿菌，這與喬曉玲[13]對廣式臘腸微生物的檢測結(jié)果相同。在發(fā)酵肉制品中，葡萄球菌能分泌蛋白酶，在一定程度上對蛋白質(zhì)有水解作用[14]，有助于提高發(fā)酵肉制品中可溶性蛋白質(zhì)和游離氨基酸的含量，對發(fā)酵肉制品風味的形成有重要意義，乳酸細菌則主要是降低了環(huán)境中的pH值，抑制了部分腐敗和病原微生物，提高了產(chǎn)品的安全，延長了貨架期[15]。將分離所得的葡萄球菌和乳酸菌相結(jié)合，組成發(fā)酵劑，檢驗其安全性，驗證其發(fā)酵效果，最終可得到安全高效的廣式臘腸發(fā)酵劑，為廣式臘腸的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

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