響應(yīng)面法優(yōu)化枸杞葉粗多糖提取純化工藝及其降血糖活性

江 磊，梅麗娟，劉增根，李潔瓊，王啟蘭，邵 赟，陶燕鐸,*

(1.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧 810008；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

糖尿病是一種臨床表現(xiàn)為高血糖的系統(tǒng)性疾病，它的直接引發(fā)原因是胰島素分泌不足，這種病會(huì)引起體內(nèi)糖類、蛋白質(zhì)和脂類代謝紊亂[1]。在糖尿病患者中，90%的病人都屬于Ⅱ型糖尿病。患這種糖尿病的病人群體數(shù)量有擴(kuò)張趨勢(shì)，這種病給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。持續(xù)性高血糖可以引起體內(nèi)非酶反應(yīng)的蛋白糖基化，從而在臨床上表現(xiàn)為糖尿病的復(fù)雜病理特征[3]。控制餐后血糖就變成了治療糖尿病過(guò)程中的一個(gè)重點(diǎn)[4]。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，淀粉的消化主要在小腸內(nèi)，首先由α-淀粉酶將長(zhǎng)鏈淀粉分子消化為直鏈或支鏈的低聚麥芽糖，然后由α-糖苷酶將這些低聚糖消化為葡萄糖[5]。因而抑制α-糖苷酶活性就成了控制餐后血糖的關(guān)鍵[6]。

枸杞葉俗稱天精草，《本草綱目》中稱枸杞葉“有除煩益志補(bǔ)五勞七傷、壯心氣、除熱毒、散瘡腫、除風(fēng)明目”之功效。據(jù)研究，枸杞葉的活性成分與枸杞果實(shí)基本一致，而且在某些營(yíng)養(yǎng)元素上甚至超過(guò)枸杞果實(shí)[7]。據(jù)報(bào)道枸杞多糖具有減輕Ⅱ型糖尿病小鼠胰島素抵抗[8]，誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和增強(qiáng)T細(xì)胞增殖[9]，增強(qiáng)人外周血巨噬細(xì)胞的免疫功能[10]，治療胃潰瘍[11]，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞[12]和抑制人食管癌細(xì)胞Eca-109的生長(zhǎng)增殖[13]等生理功效。枸杞葉多糖可能和枸杞多糖一樣具有這些功效。為了研究枸杞葉多糖的藥用價(jià)值，其提取純化方法變得至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法對(duì)枸杞粗多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，利用大孔樹(shù)脂和DEAE弱陰離子交換柱對(duì)枸杞葉粗多糖進(jìn)行了純化，用α-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)的方法測(cè)定了枸杞葉精多糖對(duì)α-糖苷酶的抑制活性，從而估計(jì)枸杞葉精多糖的降血糖活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

取25℃條件下陰干的枸杞葉，于60～80℃烘干2h，經(jīng)粉碎、干燥至質(zhì)量恒定后備用。

p-NPG、α-糖苷酶(E.C.3.2.1.20) 美國(guó)Sigma 公司。DEAE-52陰離子交換柱柱料 美國(guó)Amresco公司；D101大孔樹(shù)脂 天津南大樹(shù)脂科技有限公司。苯酚、濃硫酸等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800型紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 日本島津公司；HH-6恒溫水浴鍋 鄭州杜甫儀器廠；AE240S型電子分析天平 德國(guó)梅特勒-托利多公司；Model 680酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 多糖含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取100mg葡萄糖，以去離子水溶解并定容至100mL，精確量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作液(1mg/mL)0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別置于試管中，各加去離子水使成2mL，各管中葡萄糖的質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mg/mL。吸取上述各管中的葡萄糖溶液0.6mL至于干凈試管中，加6%苯酚試劑1.2mL搖勻。迅速滴加濃硫酸6.0mL，并迅速搖勻。靜置5min，沸水浴15min取出。流動(dòng)水冷卻至室溫。另以0.6mL去離子水同樣操作，作空白對(duì)照，在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)、吸光度A為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并得其回歸方程為A＝9.75C－1.09(R2＝0.9995)。

多糖含量的測(cè)定參考方崇波等[14]的方法稍作修改。精密稱取一定質(zhì)量的枸杞葉粗多糖樣品，測(cè)定吸光度后計(jì)算葡萄糖質(zhì)量濃度后，按照下式計(jì)算枸杞葉粗多糖樣品中多糖的含量：

式中：C1為葡萄糖的質(zhì)量濃度；V是樣品溶液總體積；m為樣品總質(zhì)量；D為樣品稀釋倍數(shù)。

1.4 基本提取工藝流程

枸杞葉粗多糖制備的基本工藝流程：陰干的枸杞葉經(jīng)粉碎后過(guò)100目篩→熱水浸漬提取→離心取上清液(4000r/min，10min)→乙醇沉淀→離心取沉淀(4000r/min，10min)→乙醇洗滌→干燥溶劑→枸杞葉粗多糖。

1.5 單因素試驗(yàn)

設(shè)定溫度70℃、浸提時(shí)間2h、料液比(枸杞葉粗粉與水質(zhì)量比)1：50，固定其他條件分別考察料液比(1：30、1：40、1：50、1：60)、浸提溫度(60、70、80、90℃)、浸提時(shí)間(l、2、3、4h)對(duì)枸杞葉粗多糖得率的影響。

1.6 響應(yīng)面法對(duì)工藝進(jìn)行優(yōu)化

利用響應(yīng)面法，對(duì)水解條件進(jìn)行優(yōu)化。以多糖含量作為響應(yīng)值，試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

表 1 水解工藝的試驗(yàn)因素編碼表Table 1 Independent variables and their coded levels used in response surface analysis

1.7 枸杞葉粗多糖的純化

首先將枸杞葉陰干粉碎，于90℃純水中浸漬5h，離心取上清液并加入無(wú)水乙醇使最終醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到85%后于常溫沉淀2h。將沉淀用無(wú)水乙醇洗滌2次，干燥后得到枸杞葉粗多糖。最后將枸杞葉粗多糖于4℃保存待用。

將上述干燥的枸杞葉粗多糖小心溶于去離子水中，并將此多糖溶液通過(guò)已處理的D101大孔樹(shù)脂柱，流速10mL/min。再用去離子水以相同的流速用3倍柱體積的流量進(jìn)行洗柱。小極性雜質(zhì)均吸附在大孔樹(shù)脂上，去離子水洗脫下的組分即為第一步純化后的枸杞葉多糖溶液。將此多糖溶液冷凍干燥后于4℃保存待用。

將第1步純化中多糖凍干粉用去離子水溶解，溶解時(shí)應(yīng)注意要盡可能的增加溶液的濃度。將多糖溶液通過(guò)已用去離子水平衡的DEAE-52柱分離，流速 0.15mL/min。在進(jìn)行洗脫時(shí)流速為1mL/min，首先用3倍柱體積的去離子水洗柱，除去不能吸附的雜質(zhì)，然后用1.0mol/L的NaCl溶液進(jìn)行洗脫。將洗脫液透析除鹽后冷凍干燥即為純化后的枸杞葉精多糖(PO)，于4℃保存待用。

1.8 PO的α-糖苷酶抑制活性測(cè)定

1.8.1 樣品溶液的制備

首先配制2mg/mL的PO溶液，用去離子水稀釋成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1mg/mL。陽(yáng)性對(duì)照藥阿卡波糖配成1.0mg/mL。

1.8.2 α-糖苷酶抑制活力的測(cè)定

參考康文藝等[15]的方法稍作修改。將5U的α-糖苷酶溶于50mmol/L的pH7.4的磷酸緩沖液中定容至1mL制成酶液。將待測(cè)樣品精確稱取10mg定溶于1mL相同的磷酸緩沖液中制成樣品溶液。取1mL相同的磷酸緩沖液用作空白對(duì)照。首先在96孔板中加入酶液20μL和樣品液40μL，37℃水浴10min。然后用排槍快速加入60μL的20mmol/L的P-NPG溶液，37℃水浴10min。反應(yīng)結(jié)束后，立即用排槍快速加入0.2mol/L Na2CO3(160μL/孔)。將96孔板置于酶標(biāo)儀上用405nm波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，α-糖苷酶活性抑制率計(jì)算公式如下：

式中：A0為空白的吸光度；A1為樣品吸光度。

1.9 統(tǒng)計(jì)與分析

本實(shí)驗(yàn)采用SAS 9.1軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)多糖含量的影響

圖 1 料液比對(duì)枸杞葉多糖含量的影響Fig.1 Effect of solid-to-solvent ratio on polysaccharides content of crude extracts

由圖l可知，料液比在1：30～1：40范圍內(nèi)，枸杞葉粗多糖含量迅速上升，從6.57%上升到6.82%，增加了2.50%。但是在1：40～1：60范圍內(nèi)，枸杞葉粗多糖含量上升緩慢，增加了0.09%。從實(shí)際生產(chǎn)成本綜合考慮，選取1：30、1：40和1：50三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.2 提取溫度對(duì)多糖含量的影響

圖 2 提取溫度對(duì)多糖含量的影響Fig.2 Effect of temperature on polysaccharides content of crude extracts

提取溫度為60℃時(shí)，多糖含量為6.64%；提取溫度為80℃時(shí)，多糖含量迅速上升到6.71%；當(dāng)提取溫度從80℃上升到90℃時(shí)，多糖含量增加緩慢，提高了0.08%，因此選擇提取溫度水平60、70℃和80℃進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)多糖含量的影響

提取時(shí)間為1h時(shí)，多糖含量較低，為6.47%；當(dāng)浸提時(shí)間為2h時(shí)，多糖含量有較大幅度的提高，為6.63%。提取時(shí)間為3h和4h時(shí)，多糖含量分別為6.85%和6.91%。但3h后上升緩慢，因此選擇1、2h和3h進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖 3 提取時(shí)間對(duì)粗多糖含量的影響Fig.3 Effect of time on polysaccharides content of crude extracts

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

表 2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及響應(yīng)值Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

應(yīng)用SAS 9.1統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果(表2)進(jìn)行多元二次回歸分析，將極不顯著的項(xiàng)(X3)剔除之后，可以得到回歸方程：

表 3 回歸分析表Table 3 Analysis of variance for the fi tted regression model

如表3所示，對(duì)回歸方程的各因子和總體進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明各應(yīng)變量與全體自變量多元回歸關(guān)系顯著，因此可以用回歸值代替真實(shí)值對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。

圖 4 各因素交互作用對(duì)多糖含量的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plots for the effect of extraction parameters on polysaccharides content of crude extracts

如圖4A所示，在一定范圍內(nèi)，多糖含量隨料液比和提取溫度的升高而升高，顯出極顯著的交互作用關(guān)系，圖4B和4C同樣可以觀察到。隨著溫度的升高，多糖分子內(nèi)能增加，分子運(yùn)動(dòng)加劇，溶解性增強(qiáng)；而溫度過(guò)高會(huì)破壞多糖分子，促進(jìn)雜質(zhì)溶入，造成最后樣品中多糖含量偏低。因此溫度只能控制在一個(gè)合適的范圍內(nèi)。如果料液比太大，溶劑溶解多糖的能力有限，會(huì)造成多糖含量低；而料液比太小又會(huì)使許多雜質(zhì)成分溶入提取液中，也會(huì)造成多糖含量低。因此料液比也只能控制在一個(gè)合適的范圍內(nèi)。提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)促進(jìn)雜質(zhì)成分的溶入，而提取時(shí)間太短會(huì)降低多糖分子溶解量，因此提取時(shí)間也只能控制在一個(gè)合適的范圍內(nèi)。

根據(jù)圖4觀察最佳水解條件近似為：料液比1：50、溫度70℃、時(shí)間2h。為了得到準(zhǔn)確的工藝條件，將多元二次方程兩邊分別對(duì)X1、X2、X3做一階偏微分，對(duì)方程組的一階偏導(dǎo)取值為零，得到方程組：

解得最優(yōu)條件為X1＝0.1458、X2＝0.1298、X3＝0.1194，即：料液比1：47.2、溫度72.9℃、時(shí)間2.2h。

2.3 對(duì)最優(yōu)提取工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

利用2.2節(jié)中得到的最佳提取工藝參數(shù)，料液比1：47.2、溫度72.9℃、時(shí)間2.2h，平行進(jìn)行5次實(shí)際提取實(shí)驗(yàn)，得到的多糖含量為(7.24±0.41)%，與模型值7.36%相近，再次驗(yàn)證了回歸模型的正確性。

2.4 α-糖苷酶抑制活性的測(cè)定

經(jīng)苯酚硫酸法檢驗(yàn)，純化后多糖含量為92.5%(后文中的枸杞葉多糖指的是提純后的枸杞葉多糖)。將純化后的多糖用于α-糖苷酶活性的檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示，枸杞葉多糖在質(zhì)量濃度范圍0.3～0.7mg/mL范圍內(nèi)對(duì)α-糖苷酶的抑制活力表現(xiàn)出強(qiáng)烈的質(zhì)量濃度依賴性，在質(zhì)量濃度大于0.8mg/mL時(shí)進(jìn)入平臺(tái)期，抑制活力隨抑制劑質(zhì)量濃度增大變化不大。這表明PO具有抑制糖吸收的功能，具有降糖的功效。由表4可知，在相同質(zhì)量濃度1mg/mL下，枸杞葉多糖的抑制率達(dá)93.7%，而阿卡波糖(Acarbose)僅為21.7%。枸杞葉多糖對(duì)α-糖苷酶半數(shù)抑制率IC50＝0.51mg/mL。

圖 5 PO的抑制率隨質(zhì)量濃度變化的關(guān)系Fig.5 Relationship of α-glycosidase inhibitory activity and concentration of purifi ed polysaccharides

表 4 空白、陽(yáng)性藥物、PO對(duì)α-糖苷酶的抑制率比較Table 4 Comparison of α-glycosidase inhibitory activity of acarbose and purifi ed polysaccharides

3 結(jié) 論

采用熱水浸提法提取枸杞葉粗多糖，其工藝參數(shù)用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，得到的回歸方程的R2＝0.9942，說(shuō)明擬合方程可以很好地描述實(shí)際值。優(yōu)化的工藝參數(shù)結(jié)果為：料液比1：47.2、溫度72.9℃、時(shí)間2.2h，此條件下多糖含量為(7.24±0.41)%，工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明最大工藝條件可靠。采用大孔樹(shù)脂和DEAE陰離子交換樹(shù)脂對(duì)枸杞葉多糖進(jìn)行純化，純化后含量升至92.5%。用純化后的多糖進(jìn)行α-糖苷酶抑制劑活性檢測(cè)，結(jié)果表明枸杞葉精多糖是一種很好的α-糖苷酶抑制劑，其IC50＝0.51mg/mL。

[1] STEPHENS J, BOTTEMAN M, HAY J. Economic impact of antidiabetic medications and glycemic control on managed care organizations： a review of the literature[J]. Journal of Managed Care Pharmacy, 2006, 12(2)： 130-142.

[2] YACH D, STUCKLER D, BROWNELL K. Epidemiologic and economic consequences of the global epidemics of obesity and diabetes[J]. Nature Medicine, 2006, 12(2)： 62-66.

[3] LEBOIVTZ H E. Postprandial hyperglycemic state： importance and consequences[J]. Diabetes Research and Clinical Practice, 1998, 40(Suppl1)： S27-S28.

[4] BARON A. Postprandial hyperglycemia and alpha-glucosidase inhibitors[J]. Diabetes Research and Clinical Practice, 1998, 40(Suppl1)： 51-55.

[5] CASIROLA D M, FERRARIS R P. Alpha-glucosidase inhibitors prevent diet induced increases in intestinal sugar transport in diabetic mice[J]. Metabolism, 2006, 55(6)： 832-841.

[6] NAKAMURA K, YAMAGISHI S, MATSUI T, et al. Acarbose, an alphaglucosidase inhibitor, improves insulin resistance in fructose-fed rats[J]. Drugs under Experimental and Clinical Research, 2005, 31(4)： 155-159.

[7] 賀曉惠, 賈孟輝, 俞維, 等. 寧夏枸杞葉基礎(chǔ)研究述要及應(yīng)用開(kāi)發(fā)的前景[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2007, 5(1)： 1111-1112.

[8] 宗燦華, 田麗梅. 枸杞多糖對(duì)2型糖尿病胰島素抵抗模型大鼠resistin基因表達(dá)的影響[J]. 藥物生物技術(shù), 2008, 15(4)： 275-277.

[9] 張純清, 單鐵英, 楊書(shū)良, 等. 枸杞多糖對(duì)誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和增強(qiáng)T細(xì)胞增殖的影響[J]. 重慶醫(yī)學(xué), 2010, 39(16)： 2117-2118.

[10] 許忠新, 單鐵英, 蘇安英, 等. 枸杞多糖對(duì)人外周血巨噬細(xì)胞活性的影響[J]. 重慶醫(yī)學(xué), 2010, 39(16)： 2177-2178.

[11] 張一芳, 馮怡, 徐德生. 枸杞多糖對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍的作用研究[J]. 中國(guó)藥業(yè), 2011, 20(1)： 14-15.

[12] 李鵬, 尹雅玲, 盧光洲, 等. 枸杞多糖抑制對(duì)硫磷致血管內(nèi)皮功能損傷的研究[J]. 天津醫(yī)藥, 2011, 39(1)： 56-58.

[13] 單鐵英, 孫健, 王芳, 等. 枸杞多糖誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞Eca-109凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2010, 21(7)： 1642-1643.

[14] 方崇波, 趙夏雨, 吳巧鳳. 苯酚硫酸法測(cè)定獼猴桃多糖注射劑中多糖的含量[J]. 海峽藥學(xué), 2010, 22(10)： 64-66.

[15] 康文藝, 張麗, 陳林, 等. 兩種唇形科植物荔枝草和夏至草α-糖苷酶抑制活性研究[J]. 中成藥, 2010, 32(3)： 493-495.