運動性疲勞對大鼠腦組織內HDAC2表達的影響＊

西安體育學院運動醫學教研室（西安710068） 張葆欣 劉遠新 苗常青

研究表明，HDAC2（組蛋白脫乙酰基酶2）是學習和記憶功能的負調控因子，研究用小鼠基因獲得或缺失功能模型具體闡明了HDAC2的抑制記憶形成。HDAC2在腦部的過表達能減少樹突棘和神經元的密度、突觸數及突觸可塑性，相反如果腦部的HDAC2缺乏能導致突觸的數量增加，從而促進記憶形成［1］。HDAC2是1996年首先由Yang等［2］從人的Hela細胞cDNA文庫篩選得到的，它與另外2個哺乳動物的組蛋白脫乙酰基酶HDAC1和HDAC3具有相似的結構和某些相同的功能，屬于同一家族。它們共同存在于細胞中，但各個組蛋白脫乙酰基酶也有其不同的功能。HDAC2被認為與在神經可塑性及記憶中所涉及的基因相關聯。本實驗采取10d游泳運動建立動物的疲勞模型［3］，通過避暗穿梭法檢測大鼠學習記憶功能受損情況，同時檢測大鼠大腦皮層、海馬CA1區內HDAC2蛋白表達，從而為闡明運動性疲勞所致大鼠學習記憶障礙的發病機理提供實驗依據。

材料與方法

1 實驗動物及分組 選用2月齡成年雄性SD大鼠24只，體重200～250g，SPF級，活動能力相近，由西安交通大學醫學院動物實驗中心提供。購入后隨機分為3組，正常對照組（NC）、運動后疲勞即刻組（FC）和運動疲勞后恢復90min組（FR）。動物房由固定的專門人員進行飼養，室溫控制在20℃～25℃，濕度40%～60%。自然節律采光，均喂飼普通飼料，自由飲水和進食。

2 大鼠運動性疲勞模型的建立 購入后適應性飼養1周后通過游泳訓練的方式建立SD大鼠的運動性疲勞模型。NC組大鼠不進行任何的游泳訓練，運動組動物在建模型之前先適應性游泳3d。訓練在120cm×65cm×85cm大游泳桶中進行，保持水深80cm，水溫（24±2）℃，每天1次訓練，每次約20min。3d適應性訓練后開始建立10d正式訓練，前7d每天1次訓練，持續3h；最后2d每天2次訓練，2次訓練間隔6h。建模期間要時刻觀察大鼠體重、活動狀態及運動能力的變化以準確判斷疲勞的程度。

3 避暗穿梭實驗 采用避暗穿梭測試儀，將大鼠放在明暗對比明顯兩個相通的箱室（有隔板分開）時。當大鼠在明箱適應30s后人為的打開通道，一進入暗箱時立刻施加電擊從而獲得記憶。24h后再將大鼠放入明箱，記錄從放入明箱到第一次鉆洞進入暗箱的時間即潛伏期，同時記錄其進入暗箱的錯誤次數。以300s的時間為限，若300s內不進入暗箱則該大鼠的記憶保持良好。同時24h后檢測首次進入暗室的時間（潛伏期）和進入暗室的次數（錯誤次數），以評價大鼠的記憶能力。

4 HDAC2蛋白的免疫組織化學實驗 采用腹腔麻醉（巴比妥鈉）大鼠，經心臟快速灌注沖洗約250ml生理鹽水，選用4%多聚甲醛約500ml（PBS配制，pH7．4）進行灌注沖洗固定，然后取全腦經4%多聚甲醛進行后固定約20h，再進行脫水、包埋、切片，按照HDAC2蛋白免疫組化染色試劑盒說明采用SABC法進行染色操作。

5 統計學分析 分析選用Olympus顯微鏡與計算機影像系統相結合，從每只大鼠腦片中隨機選取5張，同時在大腦皮層和海馬CA1區各選5個視野分別對各組染色切片中HDAC2蛋白陽性表達進行定量分析，于各個視野下計算陽性細胞的積分光密度（IOD）值，并取5個視野下的IOD之和。獲取數據以±s表示。采用SPSS16．0統計軟件包進行單因素方差分析，方差不齊時用秩和檢驗。

結 果

1 大鼠的一般情況 10d的疲勞模型成功建立后NC組表現為體重增長，活動狀況良好。FC、FR組多數大鼠出現精神不佳，體重增長慢，活動及覓食減少，毛發無光澤等狀況。

2 避暗穿梭實驗 見表1。FC組與NC組相比，大鼠避暗潛伏期縮短，錯誤次數增加，統計學上有顯著性差異。FR組避暗潛伏期和錯誤次數較FC組有所恢復，但與NC組相比仍有顯著差異。表明本實驗設計的運動性疲勞致大鼠學習記憶障礙模型基本建立成功。

表1 不同組別大鼠避暗穿梭實驗結果（n＝8，±s）

表1 不同組別大鼠避暗穿梭實驗結果（n＝8，±s）

注：與NC組相比＊P＜0．05，＊＊P＜0．01

組 別 n 避暗潛伏期（s） 錯誤次數（次）8 215．5±23．5 2．1±0．3 FC組 8 64．3±8．5＊＊ 8．5±2．1＊FR組 8 109．7±8．3＊＊ 6．9±0．8 NC組＊

3 腦內HDAC2免疫陽性細胞的表達與分布

見表2。HDAC2在大鼠的大腦皮層和海馬神經細胞的胞核均有表達。NC組大鼠大腦皮層和海馬HDAC2蛋白胞核著色淡；FC組和FR組大鼠的大腦皮層及海馬HDAC2蛋白表達與NC組比明顯上調且有顯著性差異，胞核的著色較深，呈棕黃或棕褐色。

表2 不同組別大鼠大腦皮層及海馬HDAC2蛋白免疫組化結果（±s）

表2 不同組別大鼠大腦皮層及海馬HDAC2蛋白免疫組化結果（±s）

注：與NC組相比＊P＜0．05，＊＊P＜0．01

組44．0±5．5 45．0±4．1 FC組 75．2±4．5＊ 76．7±6．5＊FR組 60．7±4．0＊＊ 63．1±5．9大腦皮層 海馬NC組別＊

討 論

研究顯示HDAC2主要位于細胞核內，是聯系健康和疾病的一個關鍵因素，在胚胎的發育中起著關鍵的作用，是影響免疫反應有關的細胞因子信號，在實體瘤中常常呈過表達趨勢［4］。同時HDAC2在成熟的神經元突觸傳遞中也起著重要的作用［5－6］。近年來關于HDAC2與學習記憶功能的研究越來越多，HDAC2對學習與記憶的功能可能起負調控作用。

本實驗研究顯示FC組大鼠避暗潛伏期縮短，錯誤次數出現相應增加，同NC組相比差異顯著；而FR組大鼠避暗潛伏期、錯誤次數與FC組相比均有所恢復，但與NC組相比差異仍顯著。提示運動性疲勞可能明顯損害SD大鼠的學習記憶功能。

本實驗取材部位均是參與學習記憶功能的重要腦區（大鼠大腦皮層及海馬CA1區），實驗結果顯示FC組大腦皮層及海馬CA1區內的HDAC2表達顯著上調，FR組HDAC2表達水平較疲勞后即刻有所恢復，但與NC組相比仍有顯著差異，提示運動性疲勞后大鼠的學習記憶能力可能出現顯著下降。疲勞即刻和恢復90min組大鼠學習記憶功能均有不同程度的損傷，而HDAC2表達上調可能是其損害學習記憶功能的重要突觸機制之一，且這種損害作用在短期內得不到很好的恢復。由此我們可以推斷運動性疲勞致大鼠學習記憶功能損傷可能與大鼠大腦皮層和海馬內HDAC2蛋白的表達變化相關，其具體的機制還有待進一步的研究闡明。

［1］ Guan JS，Haggarty SJ，Giacometti E，et al．HDAC2negatively regulates memory formation and synaptic plasticity［J］．Nature，2009，459（7243）：55－60．

［2］ Yang WM，Inouye C，Zeng YY，et al．Transcriptional repression by YY1is mediated by interaction with a mammalian homolog of the teast global regulator RPD3［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1996，93：12845－12850．

［3］ 侯莉娟，劉曉莉，喬德才．大鼠游泳運動疲勞模型建立的研究［J］．實驗動物科學與管理，2005，22（1）：1－3．

［4］ Kramer OH．HDAC2：a critical factor in health and disease［J］．Trends Pharmacol Sci，2009，30（12）：647－655．

［5］ Montgomery RL，Hsieh J，Barbosa AC，et al．Histone deacetylases 1and 2control the progression of neural precursors to neurons during brain development［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（19）：7876－7881．

［6］ Akhtar MW，Raingo J，Nelson ED，et al．Histone deacetylases 1and 2form a developmental switch that controls excitatory synapse maturation and function［J］．J Neurosci，2009，29（25）：8288－8297．