子宮內膜輕創術對子宮內膜容受相關因子表達的影響＊

江蘇省常州市婦幼保健院生殖中心（常州213003） 黃曉陽 陳 莉 楊海燕 許培箴 邢寶玲

子宮內膜容受性是指子宮內膜對胚胎的接受能力，即子宮內膜處于一種允許胚胎粘附，穿透并使胚胎間質發生改變從而使胚胎著床的狀態，直接影響胚胎能否種植成功［1］，是一個涉及到胚胎組織和子宮內膜之間多種細胞因子和生長因子的復雜多階段的過程。目前IVF著床失敗病例中有三分之二是因為子宮內膜容受性的原因［2］。近年來如何改善子宮內膜容受性已經成為研究的熱點，其中包括子宮內膜輕創術［3］，但是其作用機理尚不清楚，什么時間進行輕創是最佳時機也無定論。本研究通過電子顯微鏡和分子生物學方法觀察輕創前后及不同時間輕創后著床期子宮內膜胞飲突、整合素β3、同源框基因（HOXA－10）表達的變化，以探討輕創術對提高子宮內膜容受性的作用及在月經早卵泡期、中卵泡期和晚卵泡進行輕創術的差異。

資料與方法

1 一般資料 選擇2010年1月至2011年10月，我院行IVF不孕患者90例，均簽署有關知情同意書。病例納入標準：年齡22～38歲；有規律排卵；不孕原因為輸卵管因素，男方因素，且經宮腔鏡或子宮輸卵管碘油造影排除子宮因素，無子宮內膜息肉；助孕周期前3個月內未口服避孕藥或放置宮內節育器；助孕周期前1年內無流產、分娩、診刮或盆腔感染；既往有過一次宮內妊娠，全部患者婦科檢查無陰道炎癥，無結核病史。90例隨機分為3組：A組（30例）：月經第3天對子宮內膜進行行輕創術，B組（30例）：月經第7天對子宮內膜進行輕創術，C組（30例）：月經第11天對子宮內膜進行輕創術，所有患者均在輕創前1周期和輕創周期排卵后7d行子宮內膜微活檢術獲取子宮內膜。3組臨床相關數據比較，無統計學差異（P＞0．05），見表1。

表1 3組輕創組臨床相關數據（±s，n＝30）

表1 3組輕創組臨床相關數據（±s，n＝30）

31．2±2．1 32．5±1．9 31．9±1．5不孕原因輸卵管 18（60%） 16（53．33%） 15（50%）男性 10（33．33%） 12（40%） 10（33．33%）其它 2（6．67%） 2（6．67%） 5（16．6%）不孕時間（年） 4．2±1．2 5．1±1．3 4．8±1．6排卵日內膜厚度（mm）A B C年齡指 標10．1±1．5 11．4±1．6 10．5±1．7

2 方 法 ①子宮內膜輕創術：常規消毒鋪巾，在B超引導下，由專人用特小號刮匙表淺地搔刮宮腔各面。②子宮內膜微活檢術：排卵后7d，常規消毒鋪巾，用直徑3mm的宮腔組織吸引管（立可靈）進入宮腔底部，向外抽內芯，利用其負壓作用，自宮腔底部及宮壁多處取得微量內膜組織待用。③卵泡超聲檢查：采用B型超聲診斷儀（ALOKA）進行自然周期卵泡監測，陰道探頭頻率7．5MHz，由專人操作，所有患者均于月經第12天開始接受檢查，當優勢卵泡達到15mm，開始每天監測B超，直至卵泡成熟及排卵。④將待用的每份新鮮子宮內膜標本用生理鹽水反復沖洗分為2份，1份放入4%戊二醛固定備做掃描電鏡觀察胞飲突，另一份放入4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后石蠟包埋，用作免疫組化檢測整合素β3、HOXA－10。

3 觀察項目 ①掃描電鏡胞飲突觀察：每份標本由2人同時觀察20個視野，選取其中有代表性的5幀，按Nikas等的方法，計算內膜表面被覆胞飲突面積的百分比，＜20%為較少，20%～50%為中等，＞50%為豐富，每例標本的結果為5幀畫面的平均值。②免疫組化檢測：采用SP法檢測整合素β3、HOXA－10蛋白在子宮內膜的表達，免疫組化的方法按照試劑盒說明書進行。兔單克隆抗體整合素β3為宜百康生物科技股份有限公司產品，兔多克隆抗體HOXA－10為上海玉博生物科技有限公司產品，根據Watanabe免疫組化半定量評分標準評分，高倍鏡下連續觀察5個視野（200倍），視野里棕黃色顆粒為陽性著色，按細胞比率和染色的強度分為5個級別：陽性細胞＜5%，未被染色為陰性（－），計為0分；陽性細胞5%～15%，呈淺棕色為弱陽性（±），計為1分；陽性細胞15%～30%，棕色為陽性（＋），計為2分；陽性細胞30%～50%，深棕色為陽性（2＋），計為3分；陽性細胞＞50%，棕褐色為強陽性（3＋），計為4分。

4 統計學方法 采用用SPSS13．0統計軟件包分析結果，計量資料采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

1 胞飲突、整合素β3、HOXA－10結果 見表2，圖1～2。術后胞飲突表達較術前更為豐富，整合素β3，HOXA10表達較術前增強，結果有統計學差異（P＜0．05）。掃描電鏡：所有子宮內膜標本都可以發現胞飲突的陽性表達，位于面向子宮宮腔的上皮細胞頂端膜表面，發育完全的胞飲突大小一致，邊界清楚，其表面的微絨毛消失而變得光滑，呈蘑菇樣外觀。但術前多為發育中胞飲突，發育完全胞飲突所占比例較少；輕創術后胞飲突發育更為完全，微絨毛少，表面光滑。免疫組化觀察結果：子宮內膜免疫組化結果在光學顯微鏡下觀察可見，輕創術前腺體少，血管少，腺腔內無分泌物，間質致密，內膜腺體與間質發育不同步，輕創術后腺體明顯增多，血管充盈明顯，腺體發育與間質同步。整合素β3表達在子宮內膜腺上皮細胞和間質細胞胞膜和胞漿上；HOXA10表達于子宮內膜腺上皮細胞及間質細胞核中，輕創術后兩者的表達均比輕創術前有明顯地增強（P＜0．05）。

表2 輕創術前后子宮內膜胞飲突、整合素β3、HOXA10表達自身對照（n＝90）

圖1 輕創術前后子宮內膜整合素β3表達（免疫組化SP法×400）

圖2 輕創術前后子宮內膜HOXA－10表達（免疫組化SP法×400）

2 不同時間輕創術后子宮內膜胞飲突、整合素β3、HOXA10表達比較 見表3～4。輕創術前3組胞飲突，整合素β3，HOXA10表達無統計學差異（P＞0．05）；術后A組三者的表達明顯高于B組和C組，結果有統計學差異（P＜0．05）

表3 3組輕創術前胞飲突、整合素β3、HOXA10表達的比較（n＝30）

表4 3組輕創術后胞飲突、整合素β3、HOXA10表達的比較（n＝30）

討 論

1 輕創術對子宮內膜容受性的影響 子宮內膜容受性可以從形態學，超聲學及分子生物學等方面進行評價。在子宮內膜形態學方面，胞飲突作為子宮內膜容受性的指標已經被眾多學者證實，它是植入窗口期子宮內膜上皮細胞頂端出現的大而平滑的胞狀突起，有研究組已證實胚胎均著床在出現胞飲突的區域，并粘附在有胞飲突細胞的頂端［4］，胞飲突在人類子宮內膜中出現在月經的第20～21d，持續時間非常短暫，大約在48h后消退，而這一時期正好與胚胎著床的窗口期相吻合［5］。本研究中取的均是排卵后一周的子宮內膜標本，正好是子宮內膜著床的窗口期，電子顯微鏡發現所有的標本中均有胞飲突出現，只是其分布和發育程度有差異。整合素β3和HOXA10是近幾年研究比較多的與子宮內膜容受性相關的因子。整合素β3是一類細胞外基質糖蛋白，屬于粘附分子超家族，由αβ兩個亞單位組成，介導細胞間及細胞和細胞外基質間的粘附和信息傳導。其中整合素β3表達于黃體中期的子宮內膜，與子宮內膜植入窗的開放同步［6－7］。HOXA屬于多基因家族，是胚胎組織形態的主要調控基因，其中對胚胎著床影響最大的是HOXA10基因，屬于腹部B組HOX基因，染色體定位于7p15～p14．2，mRNA全長2691bp，編碼785個氨基酸，是子宮內膜著床調控必不可少的基因［8］。HOXA10蛋白在子宮內膜上的表達僅限于腺上皮和間質細胞中，隨著月經周期的變化出現周期性，在著床窗口期的表達明顯上升，與血液中孕酮值升高一致［9］。并且最近研究發現，HOXA10通過和一個含41bp的調控元件的結合直接上調整合素β3的表達，HOXA10與整合素β3表達峰值時相一致［10］。本研究中，以患者輕創前后作自身對照，消除組間影響因素，較為客觀。結果顯示，輕創術后胞飲突，整合素β3，HOXA10表達比術前明顯增強，說明清創術可以提高這三者的表達，而這三種因子與子宮內膜容受性有密切的聯系，進一步證實了輕創術可以提高子宮內膜的容受性。

2 輕創術對提高子宮內膜容受性作用的機制 子宮內膜輕創術可以刺激子宮內膜，提高子宮內膜容受性的機制不明。早在1907年，有報道對準備受孕的豚鼠的子宮內膜進行搔刮，可刺激子宮內膜細胞的快速生長，并誘導其蛻膜化［11］。有大鼠試驗證實子宮內膜局部機械損傷可以使子宮內膜組胺釋放增加，繼而誘導內膜蛻膜化［12］。通過本研究結果，我們推測子宮內膜輕創術是一種機械刺激，可清除不規則增生組織，促進子宮內膜小動脈生成，改善子宮內膜局部血供，從而增加子宮內膜的容受性，并且輕創術后，著床相關因子表達明顯增加，可以提高胚胎著床的機會。

3 行輕創術的時間、方法和可行性 目前，臨床對胚胎移植中進行輕創術可以改善子宮內膜容受性已有一定的認識，但是在什么時間進行輕創術沒有達成共識。本研究將輕創術分為在早卵泡期，中卵泡期和晚卵泡期進行，研究在不同時期進行輕創術后著床相關因子的變化，結果發現在早卵泡期組進行輕創術后著床相關因子表達最強，提示有可能在早卵泡期進行輕創最有利于子宮內膜容受性的改善。在早卵泡期進行搔刮，有利于子宮內膜的修復和同步化，而且輕創術用特小號刮匙，均在B超引導下進行，動作輕柔，宮腔各壁都有刺激，最小力度最大范圍地對子宮內膜進行刺激，在嚴格無菌操作下無一例發生感染，研究證實這種輕創是有效和安全的，具有一定的可行性。由于本研究樣本量小，對于在什么時間進行輕創術是最佳時機，尚需要更加深入，細致和全面大樣本的研究。

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