慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期患者外周血Th17與Treg細(xì)胞表達及意義

石建邦，劉 輝，嚴(yán) 青，夏淮玲，徐曉玲

(1宣城市人民醫(yī)院，安徽宣城242000;2安徽省立醫(yī)院)

目前認(rèn)為慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種由毒性氣體或異常顆粒誘發(fā)，各種炎性細(xì)胞參與的全身炎癥反應(yīng)性疾病，吸煙為主要危險因素［1］。Th17細(xì)胞是近期發(fā)現(xiàn)的一種T細(xì)胞亞型，在慢性炎癥和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用;輔助性T細(xì)胞17(Th17)與CD+4CD+25Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)細(xì)胞均來源于初始T細(xì)胞，Treg細(xì)胞是一類具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，而Th17細(xì)胞被認(rèn)為是一種介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞［2］，兩者在功能和分化過程中相互遏制，在正常機體內(nèi)保持平衡，共同維持機體免疫平衡。為探討Th17與Treg細(xì)胞在COPD發(fā)病機制中的作用及吸煙對其表達的影響，我們于2011年9月～2012年5月進行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 35例于2011年8月～2012年8月在我院體檢中心健康查體者，依據(jù)吸煙史(吸煙量≥200支/年)分為健康不吸煙組(18例，A組)健康吸煙者(27例，B組);另選44例慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期患者(C組)，均有吸煙史。A組與B組納入標(biāo)準(zhǔn):①3個月內(nèi)無呼吸系統(tǒng)疾病史且1個月內(nèi)未使用任何藥物;②年齡45～75歲;③肺功能檢查正常;④無風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病、過敏性疾病及變態(tài)反應(yīng)疾病;⑤簽署知情同意書。C組納入標(biāo)準(zhǔn):①符合2007年修訂版《慢性阻塞性肺疾病診斷指南》;②年齡45～75歲;③近半年內(nèi)無急性加重史;④簽署知情同意書。C組排除標(biāo)準(zhǔn):①合并其他肺部疾病或有其他系統(tǒng)感染;②有風(fēng)濕系統(tǒng)疾病或者免疫功能缺陷;③1個月內(nèi)使用糖皮質(zhì)激素;④有嚴(yán)重的其他系統(tǒng)疾病或惡性腫瘤。各組性別和年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，B組和C組吸煙量無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并簽署知情同意書。

1.2 相關(guān)指標(biāo)檢測 抽取各組清晨空腹靜脈血8 mL，3 mL置于生化管(A管)、5 mL置于肝素抗凝管(B管)。A管高速離心收集血漿置于－80℃凍存待ELISA檢測。用5 mL生理鹽水稀釋B管血液，無菌離心管中加入5 mL淋巴細(xì)胞分離液并將稀釋的血液平鋪在離心管中，室溫下2 500 r/min離心30 min，然后吸取白膜層細(xì)胞置于另一無菌離心管中，再用10 mL生理鹽水稀釋白膜細(xì)胞，2 000 r/min離心20 min(重復(fù)2次)，收集離心細(xì)胞并用 RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、0.1 g/L鏈霉素和0.1 U/L青霉素)制成PBMC懸液，調(diào)整PBMC密度至2×106個/mL，其中2×106個用于流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17細(xì)胞。

1.2.1 外周血Th17與Treg細(xì)胞表達檢測 采用FACS法。分別取PBMC 2×106個(1 mL)于2個無菌流式細(xì)胞管(B1、B2)中，B1用于檢測Th17細(xì)胞，B2用于檢測Treg細(xì)胞。①Th17細(xì)胞檢測:B1管中加入 10 μL PMA(1 μg/mL)、10 μL 離子霉素(50 μg/mL)和1 mL 莫能菌素(2 μmol/mL)，混勻置培養(yǎng)箱中(37℃、5%CO2)培養(yǎng)5 h。取出細(xì)胞懸液用PBS洗滌離心，棄上清后加入5 μL抗人CD4-FITC單克隆抗體，振勻，避光孵育30 min;用2 mL固定破膜劑緩沖液洗滌2次，收集離心細(xì)胞并加入1 mL固定破膜劑工作液，4℃避光孵育30～60 min;用固定破膜劑緩沖液2 mL洗滌2次，加入5 μL PE標(biāo)記的抗人IL-17抗體，振勻后置4℃避光孵育30 min;用PBS洗滌后棄上清并用1%多聚甲醛固定液(0.5 mL)固定待測;上流式細(xì)胞儀檢測，以CD4直方圖設(shè)門區(qū)分細(xì)胞，以散點圖表示IL-17+細(xì)胞，用Cellquest軟件獲取并分析檢測結(jié)果。②Treg細(xì)胞檢測:B2管中加入5 μL抗人CD4-FITC和CD25-PE單克隆抗體、振勻，避光孵育30 min;用固定破膜劑緩沖液2 mL洗滌2次，收集離心細(xì)胞并加入1 mL固定破膜劑工作液，4℃避光孵育30～60 min;用固定破膜劑緩沖液2 mL洗滌2次，加入5 μL抗人Foxp3 PE-Cy5單克隆抗體，振勻后置4℃避光孵育30 min;用PBS洗滌后棄上清并用1%多聚甲醛固定液(0.5 mL)固定待測;上流式細(xì)胞儀檢測，以 CD4、CD25設(shè)門區(qū)分細(xì)胞，再測定Foxp3+細(xì)胞。

1.2.2 外周血及PBMC培養(yǎng)液中IL-17水平檢測將各組PBMC(2×106個，1 mL)加入24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1 mL RPMI 1640培養(yǎng)液制成的細(xì)胞懸液，予以100 μL植物凝集素(0.4 g/L)于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集上清置于－80℃凍存。取上述凍存血漿及PBMC培養(yǎng)上清液，采用ELISA法測定IL-17水平。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.3 相關(guān)性分析 分析相關(guān)指標(biāo)與吸煙年數(shù)及FEV1/FEV1預(yù)計值的關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用ˉx±s表示，多組均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗;定性資料用χ2檢驗。P≤0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血Th17與Treg細(xì)胞表達 見表1。

2.2 外周血及PBMC培養(yǎng)液中IL-17水平 見表2。

2.3 相關(guān)性分析 B組:外周血Th17、Treg細(xì)胞與吸煙年數(shù)均呈正相關(guān)(r=0.782，P ＜0.01;r=0.421，P=0.029)。C組:外周血Th17細(xì)胞與吸煙年數(shù)呈正相關(guān)(r=0.409，P=0.009)，Treg 細(xì)胞與吸煙年數(shù)無相關(guān)性(r=0.032，P=0.834);外周血Th17細(xì)胞百分比與FEV1/FEV1預(yù)計值無相關(guān)性(r= －0.04，P=0.979);外周血及 PBMC 刺激培養(yǎng)液中IL-17水平與FEV1/FEV1預(yù)計值均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.535，P ＜0.01;r= －0.393，P=0.008)。

表1 各組外周血Th17、Treg細(xì)胞比較(%，ˉx±s)

表2 各組外周血及PBMC培養(yǎng)液中IL-17水平比較(pg/mL，ˉx ±s)

3 討論

研究證實，吸煙可誘導(dǎo)Th17細(xì)胞增殖和活化并高分泌IL-17，后者使氣道上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞釋放IL-6和IL-8等致炎因子和趨化因子，促使中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞募集到肺部炎癥組織并分泌彈性蛋白酶破壞肺組織［3］;IL-6可強化Th17細(xì)胞的分化，且Th17細(xì)胞自分泌的IL-21能建立一個正反饋體系，并依賴核轉(zhuǎn)錄因子STAT3與IL-21啟動子結(jié)合誘導(dǎo)Th17的進一步自身分化，維持微環(huán)境中Th17細(xì)胞的數(shù)量［4］。

初始CD+4T細(xì)胞在TGF-β和IL-6共同作用下分化為Th17細(xì)胞，Th17細(xì)胞通過分泌IL-17A、IL-17F、IL-21及IL-22在自身免疫性疾病和炎癥性疾病中發(fā)揮著重要作用。IL-17在宿主防御和炎性疾病中起重要作用，連接著固有免疫和適應(yīng)性免疫機制，其不僅能誘導(dǎo)上皮細(xì)胞、成纖維母細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞分泌多種炎性因子和趨化因子，還能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的聚集和活化，釋放彈性蛋白酶、穿孔素及基質(zhì)金屬蛋白酶等破壞肺組織，促使COPD的發(fā)生和發(fā)展［5］。初始CD+4T細(xì)胞在TGF-β的單獨誘導(dǎo)下分化為Treg細(xì)胞，且能分泌TGF-β、IL-10等細(xì)胞因子并表達Foxp3，在維護機體免疫平衡中發(fā)揮重要作用［6］。Treg按其起源可分為天然型(nTreg)、誘導(dǎo)型(iTreg)和Tr1細(xì)胞。Th17和Treg細(xì)胞在機體免疫和疾病發(fā)生中起著截然不同的作用。Th17細(xì)胞主要通過分泌細(xì)胞因子促進中性粒細(xì)胞的動員、募集和活化，介導(dǎo)促炎反應(yīng);Treg細(xì)胞的免疫抑制作用在保持機體的免疫耐受性中發(fā)揮著決定性作用，其數(shù)量及功能異常與自身免疫性疾病、慢性炎癥反應(yīng)及腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系。

本研究B組及C組外周血及外周血刺激培養(yǎng)液中IL-17水平均明顯高于A組，C組又明顯高于B組，表明香煙煙霧參與了Th17細(xì)胞的活化，可上調(diào)Th17細(xì)胞的數(shù)量或功能。研究表明長期暴露于香煙煙霧的小鼠和人的肺組織內(nèi)IL-17含量明顯升高［7，8］。吸煙可誘導(dǎo) Th17細(xì)胞的增殖和活化并高分泌IL-17，使氣道上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞釋放IL-6和IL-8等致炎因子和趨化因子，促使中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞募集到肺部炎癥組織并分泌彈性蛋白酶破壞肺組織［9］。本研究 COPD穩(wěn)定期患者外周血Th17和IL-17水平及PBMC培養(yǎng)液中IL-17水平高于健康吸煙者和健康不吸煙者，表明Th17和IL-17過度表達和功能活化可能促使了COPD的發(fā)生;Th17細(xì)胞始終參與吸煙所致的全身性異常炎癥反應(yīng)，在吸煙肺功能正常者發(fā)展到COPD這一連續(xù)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮強大的促炎作用，健康吸煙者可能處于向COPD發(fā)展的危險階段，此與相關(guān)研究結(jié)果基本一致［10，12］。本研究C組外周血Th17細(xì)胞百分比與FEV1/FEV1預(yù)計值無相關(guān)性，而外周血和PBMC培養(yǎng)液中IL-17水平與FEV1/FEV1預(yù)計值呈負(fù)相關(guān)，提示外周血Th17細(xì)胞百分比與氣流受限程度明顯相關(guān)，而外周血和PBMC培養(yǎng)液中IL-17水平與氣流受限程度有關(guān)，表明氣流受限程度不同的COPD穩(wěn)定期患者中Th17細(xì)胞活性可能存在差異。本研究相關(guān)性分析表明，B、C組外周血Th17細(xì)胞均與吸煙年數(shù)有關(guān)，表明香煙煙霧參與了Th17細(xì)胞活化，可上調(diào)Th17細(xì)胞數(shù)量。

Treg細(xì)胞在體內(nèi)通過抑制體內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)維持機體免疫平衡，故理論上COPD患者體內(nèi)Treg細(xì)胞的數(shù)量應(yīng)該減少。Smyth等［13］研究提示，健康吸煙者和COPD患者肺泡灌洗液中CD+4CD+25T細(xì)胞的數(shù)量明顯高于健康不吸煙者。本研究B組和C組外周血中Treg細(xì)胞水平均明顯高于A組，C組明顯高于B組，與Maria等［10］的研究結(jié)果一致。提示在健康吸煙者逐漸發(fā)展為COPD的過程中Treg細(xì)胞逐漸失去調(diào)節(jié)功能，使得機體免疫調(diào)節(jié)功能降低;同時激活體內(nèi)反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)，促使Treg細(xì)胞數(shù)量增加，與相關(guān)研究結(jié)果相符［14］。

綜上所述，COPD穩(wěn)定期患者外周血Th17、Treg細(xì)胞和IL-17水平明顯升高;Th17細(xì)胞百分比與氣流受限程度無關(guān)，但細(xì)胞活性可能與氣流受限程度有關(guān);吸煙能夠促使Th17細(xì)胞增殖和活化，從而促使Treg細(xì)胞水平升高，可能影響Treg細(xì)胞的功能。COPD中全身的異常炎癥反應(yīng)在疾病開始時期即肺功能正常吸煙階段已經(jīng)存在，健康吸煙者隨著全身異常炎癥反應(yīng)的放大，Th17和Treg之間平衡失調(diào)，最后發(fā)展為COPD，但由于個體易感性不同，只有部分吸煙者發(fā)展為COPD。本研究為進一步研究Th17和Treg細(xì)胞在COPD發(fā)病機制中的作用提供了理論基礎(chǔ)和實驗數(shù)據(jù)，對COPD治療方法的選擇和療效評價有指導(dǎo)意義。

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