反義nm23-H1基因?qū)Π籽562細(xì)胞株侵襲及增殖的影響

戴振聲，徐成興，黃云勝，徐森華，胡新民

(1復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院南匯分院，上海201399;2復(fù)旦大學(xué)附屬上海市浦東醫(yī)院)

隨著對白血病發(fā)病機制的深入了解，基因療法治療白血病成為研究熱點。nm23基因是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，大量研究證實，其與多種實體腫瘤(如膽囊癌、肝癌、胃癌等)的預(yù)后及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［1～3］;急性淋巴細(xì)胞白血病低分化細(xì)胞中 nm23-H1表達(dá)量高于相對高分化的細(xì)胞［4］。目前關(guān)于nm23基因與慢性髓性白血病相關(guān)性的研究報道較少。2012年4月～2012年10月，我們觀察了抑制慢性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞nm23-H1基因表達(dá)對細(xì)胞增殖及侵襲的影響，旨在為分子靶向治療慢性髓性白血病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 慢性髓細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞株(上海細(xì)胞生物研究所)。試劑:脂質(zhì)體 Lipofectamin2000(Invitrogen)，G418(Sigma)，TriZol(Invitrogen)，AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司);引物由大連Takara公司合成。nm23-H1引物:5'-TrAATCAGATGGTCGGGGAT-3'， 5'-GATCTATGAATGACAGGAGG-3';退火溫度:56℃，產(chǎn)物長度:186 bp;β-actin 引物:5'-CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3'，5'-GTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3';退火溫度:54℃，產(chǎn)物長度:531 bp。

1.2 實驗方法

1.2.1 nm23-H1 的 RNAi重組體 pGCsinm23(以下簡稱pGCsinm23)構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 根據(jù)GenBank中報道的Nm23-H1基因的核苷酸序列(D1734)，參考siRNA的設(shè)計策略，通過基因Blast，挑選長為19個堿基的特異性寡核苷酸序列5'-CAAGTTGGCAGGAACATTA-3'，合成其發(fā)卡樣兩端配對siRNA寡核苷酸鏈，與用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后的pGC載體連接，合成pGCsi nm23。同時合成陰性對照質(zhì)粒(序列為TTCTCCGAACGTGTCA)。調(diào)整K562細(xì)胞濃度為2×105個/mL，以每孔2 mL接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，待細(xì)胞增至70%時采用脂質(zhì)體法行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染8 h后棄去轉(zhuǎn)染液，換含新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)1 d，棄去原培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染pGCsi nm23的細(xì)胞為觀察組，轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的細(xì)胞為對照組。觀察組轉(zhuǎn)染48 h后熒光顯微鏡下可見細(xì)胞核內(nèi)有綠色熒光，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率(=每高倍鏡視野熒光細(xì)胞數(shù)/同一視野下細(xì)胞數(shù)×100%［3］)約為40%。

1.2.2 觀察項目 以下項目觀察時間為轉(zhuǎn)染后48 h。

1.2.2.1 nm23-H1 表達(dá) ①nm23-H1 mRNA 表達(dá):采用RT-PCR法測定。分別提取兩組細(xì)胞總RNA，U-2001型紫外分光光度計定量，均取3 μg total RNA按照試劑盒反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)錄。β-actin作為內(nèi)參照，nm23-H1基因及β-actin引物序列合成均由大連Takara公司完成，序列見表1。反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃、5 min，94 ℃、30 s，按表1 溫度退火30 s，72℃、40 s共30個循環(huán);72℃延伸4 min。取10 μL產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察nm23-H1基因表達(dá)［5］。②nm23-H1蛋白表達(dá):采用Western blot法。分別提取兩組細(xì)胞總蛋白，細(xì)胞數(shù)量均為1.0×106。用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加細(xì)胞裂解液在沸水中煮10 min，后離心(20 000 rpm)10 min，取上清10 μL行SDS-PAGE電泳，經(jīng)硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1 h后，分別與nm23-H1(1∶300)單克隆抗體、β-tubulin多克隆抗體(1∶300)4℃孵育、過夜，β-tubulin為內(nèi)參照。洗滌后再分別與二抗為HRP標(biāo)記的牛抗小鼠 IgG(1∶2 500，CA)作用，經(jīng)ECL底物化學(xué)發(fā)光顯影。

1.2.2.2 細(xì)胞克隆形成能力 將兩組細(xì)胞接種于6孔板上，每孔為1×104個細(xì)胞，用含600 μg/mL G418的培養(yǎng)液進行篩選，14 d后甲醛固定細(xì)胞，姬姆薩染色20 min，沖洗染色液，觀察各平板細(xì)胞克隆形成數(shù)量。于上層膠中(1.2%低熔點瓊脂糖)加入K562單細(xì)胞懸液，滴入已鋪有下層膠(1.2%低熔點瓊脂糖)的24孔板中，每孔加5×103個細(xì)胞;培養(yǎng)箱培養(yǎng)2周;倒置顯微鏡(40×)下觀察細(xì)胞集落形成數(shù)。

1.2.2.3 細(xì)胞侵襲能力 采用 0.05%typsin/0.02%EDTA消化后分別收集兩組細(xì)胞各1×105個，稀釋成106/mL;加入100 μL細(xì)胞懸液到6-transwell小室的上室中，下室加入600 μL無血清培養(yǎng)液(內(nèi)含有多種趨化因子);培養(yǎng)24 h后HE染色，輕輕用棉簽擦凈6-transwell小室上室面無侵襲性的細(xì)胞，倒置顯微鏡(200×)下隨機選擇5個視野，計數(shù)穿過8 μm微孔膜的侵襲性細(xì)胞數(shù)，取均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，采用t檢驗，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 nm23-H1表達(dá) 兩組細(xì)胞株內(nèi)參照β-actin擴增條帶亮度幾乎一致，但轉(zhuǎn)染組目的條帶的亮度較對照組明顯減弱(圖1)，nm23-H1 mRNA表達(dá)水平亦下調(diào)(圖2)。提示nm23-H1基因被干擾后K562細(xì)胞nm23-H1表達(dá)水平降低。

2.2 細(xì)胞克隆形成能力 轉(zhuǎn)染組及對照組克隆形成數(shù)量分別為(12.14 ±3.51)、(4.32 ±0.95)個，轉(zhuǎn)染組明顯高于對照組(圖3)。兩組細(xì)胞在軟瓊脂中生長2周左右即能形成類圓形細(xì)胞集落，與對照組比較，轉(zhuǎn)染組集落體積大且形成數(shù)量多，見圖4。提示nm23-H1基因表達(dá)下調(diào)后K562細(xì)胞軟瓊脂生長能力明顯增強。

圖1 K562細(xì)胞nm23-H1 mRNA表達(dá)

圖2 K562細(xì)胞nm23-H1 mRNA表達(dá)

圖3 K562細(xì)胞平板克隆形成情況注:A:對照組;B:觀察組

圖4 K562細(xì)胞軟瓊脂克隆形成情況(40×)注:左:對照組;右:觀察組

2.3 細(xì)胞侵襲能力 觀察組及對照組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(25.33 ±3.51)、(14.33 ±4.04)個，P ＜0.05(圖5)。

圖5 K562細(xì)胞穿膜情況(200×)

3 討論

目前，白血病患者在我國的發(fā)病率正逐年上升，為2.76/10萬。總發(fā)病率在腫瘤總發(fā)病率中位列第9。慢性髓細(xì)胞性白血病(CML)是臨床上一種起病及發(fā)展相對緩慢的白血病。我國的CML發(fā)病率調(diào)查結(jié)果為年發(fā)病率0.36/10萬，與亞洲國家相近，低于歐美國家。在我國CML約占各類白血病的20%，占慢性白血病的95%.發(fā)病年齡分布較廣，但發(fā)病率隨年齡的增長有逐步上升趨勢，男性發(fā)病率高于女性。直至今天，CML的治療方案只能延緩疾病進展。基因治療白血病近年來研究較多，CML是目前應(yīng)用反義核酸技術(shù)研究最多的白血病。在眾多的基因中，nn23基因是近幾年來令人關(guān)注的基因之一，其表達(dá)水平與某些腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)，被認(rèn)為是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。在造血系統(tǒng)，nm23基因與細(xì)胞的增殖和分化活動有關(guān)，下調(diào)nn23-H1基因表達(dá)可抑制K562細(xì)胞株增殖，降低細(xì)胞的惡性程度，對于白血病患者，nm23基因表達(dá)可能是預(yù)后不良的因素［5］。本研究合成了 pGCsinm23，其轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后可有效抑制細(xì)胞中nm23-H1 mRNA及蛋白表達(dá)水平;轉(zhuǎn)染48 h后K562細(xì)胞形成的克隆體積增大，數(shù)量增多;且其體外侵襲能力明顯增強，提示nm23基因?qū)562細(xì)胞株的生長、增殖及侵襲力有明顯影響，與2005年Huang等［6］的研究結(jié)果一致，Jung等［7］認(rèn)為，nm23基因表達(dá)與肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移性密切相關(guān)，nm23基因表達(dá)可抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲的能力。

本研究結(jié)果提示，nm23基因是一個與白血病預(yù)后密切相關(guān)的抑制轉(zhuǎn)移基因。進一步需進行臨床患者外周血nm23基因表達(dá)與其預(yù)后及治療效果的研究。

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