EGCG對(duì)糖尿病腎病模型大鼠腎小管間質(zhì)性損害的治療作用及機(jī)制

馬祖等

(廣州醫(yī)學(xué)院附屬沙井醫(yī)院，廣東深圳518104)

糖尿病腎病是糖尿病微血管病變的并發(fā)癥，也是糖尿病患者最常見的死亡原因之一。30%～45%的2型糖尿病患者可發(fā)展為糖尿病腎?。?］。近年來(lái)人們認(rèn)識(shí)到糖尿病腎小管病變是糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展的獨(dú)立因素［2］，糖尿病狀態(tài)下腎小管病變的程度與蛋白尿排泄量和腎功能進(jìn)行性下降密切相關(guān)并直接影響預(yù)后。(-)-Epigallocatechin 3-O-Gallate(EGCG)具有強(qiáng)大的抗氧化應(yīng)激作用，其作用是維生素C的100倍、維生素E的25倍。EGCG對(duì)毒物、藥物等誘導(dǎo)的肝損害模型的抗氧化應(yīng)激、纖維化作用已有多篇報(bào)道［3～5］，但其對(duì)腎臟疾病的作用鮮有報(bào)道。2012年6～10月，我們觀察了EGCG對(duì)糖尿病腎病模型腎小管間質(zhì)性病變的干預(yù)作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性8～10周Wistar大鼠60只，體質(zhì)量210～230 g，平均219 g，由南華大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供［許可證號(hào):SYXK(湘)2010-0006］。EGCG購(gòu)自江西綠康天然產(chǎn)物有限公司。鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自Sigma公司。VEGF抗體(單克隆兔抗鼠抗體)、TGF-β1抗體(多克隆抗體)、RAGE 抗體(多克隆抗體)購(gòu)自Santa Cruz生物技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制作及分組 參照郭嘯華等［6］以及李莉等［7］的制模方法，60只大鼠高糖高脂飼料(含豬油10%，蔗糖20%，膽固醇2.5，膽酸鈉1%，基礎(chǔ)飼料66.5%)喂養(yǎng)4周。取16只作為正常對(duì)照組(對(duì)照組)，另44只制作糖尿病腎病模型:大鼠禁食12 h(不禁飲)，一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg(溶解于0.01 mol/L 枸椽酸緩沖液中，pH 4.5)，同時(shí)腹腔注射50%葡萄糖5 mL。對(duì)照組腹腔內(nèi)注射等量枸緣酸緩沖液。注射后48 h尾靜脈采血，采用血糖儀測(cè)定全血血糖(BG)，BG＞16.7 mmol/L為糖尿病模型制作成功。本研究制作成功糖尿病腎病模型共39只。

1.2.2 干預(yù)方法 參照張孝林等［8］的干預(yù)方法將39只模型大鼠隨機(jī)分為模型組及治療組，均皮下注射甘精胰島素2 U，每日1次，對(duì)照組皮下注射等量生理鹽水。三組均予高蛋白(酪蛋白20%，基礎(chǔ)飼料80%)飼喂。參照鄭子新等［9］方法，治療組每日以EGCE 1 g溶于生理鹽水10 mL中，每天分2次灌胃;對(duì)照組、模型組同樣方法予等量生理鹽水灌胃。保證入選大鼠足量飲水。

1.2.3 觀察指標(biāo) 干預(yù)第12周測(cè)定各組血糖、糖化血紅蛋白(HbA1c)、Cr、BUN及尿 β2微球蛋白(β2-MG)及尿微量蛋白(ULA);ELISA法測(cè)定血清TGF-β1水平;熒光分光光度法測(cè)定血清血管收縮素轉(zhuǎn)換酶(AGEs)水平;取腎組織行病理檢查，免疫組化或免疫熒光法測(cè)定腎小管間質(zhì)組織TGF-β1、晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)、VEGF表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料比較采用One-Way ANOVA檢驗(yàn)，組間比較采用t檢驗(yàn)。對(duì)觀察組與治療組觀察指標(biāo)行Post Hoc檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察指標(biāo) 各組觀察指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見表1。ANOVA分析見表2，由表2可見，三組各項(xiàng)指標(biāo)之間均存在顯著差異，特別是AGEs、ULA、血糖、TGF-β1差異更明顯。模型組與治療組觀察指標(biāo)間的Post Hoc檢驗(yàn)結(jié)果見表3，由表3可見，治療組與模型組各指標(biāo)間均存在顯著差異，以 AGEs、BUN、ULA更為顯著。2.2 腎組織病理檢查 ①HE染色:見圖1。由圖1可見，與治療組比較，模型組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)損害以及腎小管間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少更為明顯，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)更為明顯。②PAS染色:見圖2。由圖2可見，模型組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)損害明顯重于治療組，腎小球基底膜、腎小管基膜損害亦明顯重于治療組。

表1 各組觀察指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果(ˉx±s)

表2 各組觀察指標(biāo)ANOVA分析

表3 模型組與治療組觀察指標(biāo)的Post Hoc檢驗(yàn)結(jié)果

2.3 腎組織TGF-β1表達(dá) 見圖3。由圖3可見，模型組腎小管間質(zhì)損害明顯重于治療組。

2.4 腎組織RAGE表達(dá) 見圖4。由圖4可見，模型組腎小管間質(zhì)表達(dá)明顯重于治療組。

2.5 腎組織VEGF表達(dá) 見圖5。由圖5可見，模型組腎小管間質(zhì)表達(dá)明顯重于治療組。

3 討論

腎臟小管間質(zhì)包括腎小管上皮細(xì)胞、血管和間質(zhì)成分，占腎臟體積的90%以上。病變初期表現(xiàn)為腎小管基底膜增厚、小管數(shù)目增加及小管肥大，后期發(fā)生腎小管萎縮及間質(zhì)纖維化。腎間質(zhì)纖維化是所有慢性腎臟疾病進(jìn)行性發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)，比腎小球硬化更能反映腎臟受損傷的程度。

圖1 腎臟病理變化(HE染色)

圖2 腎臟病理變化(PAS染色)

圖3 腎組織TGF-β1表達(dá)(免疫組化法)

圖4 腎組織RAGE表達(dá)(免疫組化法)

圖5 腎組織VEGF表達(dá)(免疫熒光法)

本研究腎臟病理檢查顯示實(shí)驗(yàn)第12周大鼠糖尿病腎病造模成功。腎組織HE染色顯示B、C組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)異常改變，特別是B組大鼠不僅腎小球結(jié)構(gòu)異常更為明顯，腎小管上皮細(xì)胞減少、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)也更為嚴(yán)重。腎組織PAS染色顯示，腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)性損害，基底膜破壞。特別是B組，病變明顯較C組加重。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，B組BG、HbA1c明顯高于C組。反映腎功能和腎臟損害的指標(biāo)Cr、BUN、ULA、β2-MG B組也明顯高于C組。

AGEs與腎組織中的RAGE結(jié)合而激活第二信號(hào)系統(tǒng)，產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子包括 TGF-α、PDGF、IL-1等，激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB進(jìn)而轉(zhuǎn)錄靶基因(如內(nèi)皮縮血管肽、血管細(xì)胞黏附分子等)，參與糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展，對(duì)腎小球及小管間質(zhì)造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷［10］。本研究結(jié)果顯示，C組血AGEs水平低于B組，腎組織中RAGE表達(dá)亦明顯低于B組。

VEGF通過(guò)改變腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能、增加上皮細(xì)胞通透性、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)等作用參與糖尿病腎病進(jìn)展［11，12］。糖尿病腎病早期時(shí)血清VEGF顯著升高，血清VEGF與尿白蛋白排泄率之間呈明顯正相關(guān)，在糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展，尤其是尿蛋白的形成中起重要作用。本研究腎組織免疫熒光顯示，B組腎小管以及間質(zhì)VEGF表達(dá)明顯高于C組。TGF-β1是一種強(qiáng)力致纖維化因子，其重要的作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的形成，使腎細(xì)胞等合成膠原蛋白、纖維連接蛋白、蛋白多糖增加從而促進(jìn)細(xì)胞肥大、細(xì)胞外基質(zhì)增多，結(jié)果導(dǎo)致腎小球、小管間質(zhì)硬化纖維化。氧化應(yīng)激、VEGF、MCP-1等多種因素能促進(jìn)TGF-β1合成和表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，C組血TGF-β1明顯低于B組，TGF-β1在腎組織中表達(dá)也明顯低于B組。

糖尿病腎病的發(fā)生與多種因素有關(guān)，氧化應(yīng)激在糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中無(wú)疑起重要作用。已經(jīng)證實(shí)，糖基化終產(chǎn)物是糖尿病腎病的主要發(fā)生因素之一［13］，減少糖基化終產(chǎn)物能延緩糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展［14］。EGCG可能是通過(guò)抗氧化應(yīng)激、抗炎等作用減少大鼠氧化應(yīng)激產(chǎn)物AGEs-RAGE及VEGF、MCP-1等炎性介質(zhì)的產(chǎn)生并直接或間接影響TGF-β1的表達(dá)實(shí)現(xiàn)保護(hù)腎臟、延緩腎病進(jìn)展。

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