鯉魚(yú)湯對(duì)阿霉素腎病大鼠腎臟MMP-2和TIMP-2表達(dá)的影響

高 英，齊玉梅，沈 衛(wèi)，郭云良，劉宗寶，張 宇，肖慧娟

(1天津醫(yī)科大學(xué)公衛(wèi)學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生系，天津300070;2天津市第三中心醫(yī)院;3青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合中心;4青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院松山醫(yī)院)

阿霉素腎病模型是出現(xiàn)腎病綜合征表現(xiàn)并伴有小管間質(zhì)纖維化和腎小球硬化傾向的一個(gè)典型的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?］。研究表明，非腫瘤性腎臟疾病的病理改變實(shí)質(zhì)均是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)在腎小球和腎間質(zhì)中異常堆積的結(jié)果［2］。ECM的主要成分Ⅳ型膠原構(gòu)成了腎小球基底膜(GBM)的基本網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，也是腎小管基底膜(TBM)中最豐富的成分，主要受ECM的降解酶系基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)調(diào)節(jié)，其中MMP-2是降解Ⅳ型膠原最重要的酶之一，而基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-2(TIMP-2)是MMP-2內(nèi)源性抑制因子。中醫(yī)古籍及近年臨床報(bào)道認(rèn)為，鯉魚(yú)湯有利尿消腫的作用［3～5］。2011年8～11月，我們觀察了鯉魚(yú)湯對(duì)阿霉素腎病大鼠腎組織MMP-2和TIMP-2表達(dá)的影響，探討鯉魚(yú)湯利水消腫、改善蛋白尿、緩解腎臟纖維化的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 動(dòng)物:Wistar大鼠40只，8周齡，體質(zhì)量(200±20)g，SPF級(jí)，購(gòu)自山東醫(yī)藥有限公司(許可證號(hào):SLXK魯20080002)。藥物及試劑:鯉魚(yú)湯(鯉魚(yú)為購(gòu)自山東萊西產(chǎn)芝水庫(kù)8周齡野生鯉魚(yú)，按照魚(yú)水比重1∶4，先文火煎煮至開(kāi)鍋，后武火煎煮60 min，濾除魚(yú)湯;按此法再煎煮第二遍，將兩遍魚(yú)湯混合，濃縮至300%。1 mL含鯉魚(yú)3 g)用聚乙烯塑料袋分袋密封包裝，置于－20℃冰箱中備用。厄貝沙坦片(批號(hào):1A101，賽諾菲安萬(wàn)特制藥)。阿霉素(ADR，批號(hào):110402，浙江海正藥業(yè)生產(chǎn))。兔抗MMP-2親和純化抗體(批號(hào):bs-0412R)、兔抗TIMP-2親和純化抗體(批號(hào):bs-0416R)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。超敏即用型二步法檢測(cè)試劑盒(PV-9001)購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 阿霉素腎病模型制備及分組 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。尿蛋白檢測(cè)陰性后隨機(jī)取10只作為對(duì)照組，其余30只參照 Bertani［6］方法單劑量尾靜脈注射阿霉素6.2 mg/kg制作阿霉素腎病模型，制模后隨機(jī)分為模型組、厄貝沙坦組、鯉魚(yú)湯組，每組各10只。

1.2.2 干預(yù)方法 造模后1周對(duì)大鼠行灌胃干預(yù)。灌胃藥物:鯉魚(yú)湯組為300%鯉魚(yú)湯9 mL/kg(按照大鼠與人體表面積的折算系數(shù)0.018計(jì)算，相當(dāng)于70 kg正常成人劑量);厄貝沙坦組為厄貝沙坦50 mg/kg(溶解于9 mL/kg的飲用水中);模型組及對(duì)照組為9 mL/kg飲用水;均1次/d，共干預(yù)8周。

1.2.3 觀察項(xiàng)目 ①腎功能指標(biāo):收集各組造模前及造模后第1～8周晨尿及12 h尿液，記錄尿量并檢測(cè)尿蛋白濃度。干預(yù)后8周各組腹腔注射水合氯醛4 mL/kg全身麻醉，經(jīng)心臟取血＞5 mL，檢測(cè)血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr);②腎組織病理變化:干預(yù)8周后處死大鼠，取腎臟標(biāo)本置于4%多聚甲醛中固定;常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，連續(xù)冠狀位切片(厚度4 μm)，HE染色后光鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，IPP 6.0自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)下測(cè)定腎小球平均截面積(AG)，計(jì)算腎小球體積(Vc)。Vc=β/k(AG)3/2(式中β=1.38，k=1.10)，百分比評(píng)分法計(jì)算腎小管損害率，計(jì)算10個(gè)高倍鏡視野(×400)腎皮質(zhì)中發(fā)生病變(包括腎小管萎縮、膨漲、擴(kuò)張、管型、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維化)的腎小管數(shù)目占腎小管總數(shù)的百分比;③腎皮質(zhì)MMP-2、TIMP-2表達(dá):干預(yù)后第8周采用免疫組化SABC法測(cè)定。腎組織石蠟包埋、切片，加抗原修復(fù)液(EDTA-T修復(fù)液，pH=8.0)行抗原修復(fù)，室溫冷卻30～50 min，PBS沖洗3 min×2次、室溫孵育10 min，滴加一抗(MPP-2濃度1∶100;TIMP-2濃度1∶200)，再經(jīng)溫室孵育、PBS沖洗;滴加二抗，37℃孵育后PBS沖洗2 min×3次，應(yīng)用DAB溶液顯色10 min;自來(lái)水充分沖洗、復(fù)染、脫水、透明、中性樹(shù)膠加蓋封片。每張切片隨機(jī)選4個(gè)高倍鏡下腎皮質(zhì)視野(×400)，Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測(cè)定平均光密度值(OD值)，每個(gè)視野計(jì)算10個(gè)MOD值的均值作為該片的OD值，代表陽(yáng)性部位的蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件。計(jì)量資料用ˉx±s表示。尿蛋白與時(shí)間交互作用采用重復(fù)測(cè)量方差分析，多組樣本資料兩兩比較采用單因素方差分析，方差齊采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett'T3法檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎功能指標(biāo) 造模1周對(duì)照組尿蛋白明顯低于其余三組(P＜0.05)，說(shuō)明造模成功。造模5周、9周厄貝沙坦組、鯉魚(yú)湯組12 h尿蛋白均低于模型組(P＜0.05);時(shí)間因素與處理因素之間存在交互作用，模型組12 h尿蛋白量呈時(shí)間依賴性上升，而鯉魚(yú)湯組、厄貝沙坦組12 h尿蛋白含量隨時(shí)間降低，明顯低于模型組(P均＜0.05)，鯉魚(yú)湯組、厄貝沙坦組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。各組TP、ALB、Cr及BUN水平比較見(jiàn)表2。

表1 各組造模前后12 h尿蛋白水平比較(mg/12 h，ˉx±s)

表2 各組干預(yù)后 TP、ALB、BUN、Cr 比較(ˉx±s)

2.2 腎組織病理變化 第9周末模型組腎組織光鏡下可見(jiàn)腎小管蛋白管型、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)纖維化及腎小球硬化。模型組大鼠腎小球截面積、腎小球體積及腎小管損害率高于對(duì)照組組(P＜0.05)，并出現(xiàn)小管纖維化、膨脹、管型等腎小管損害。鯉魚(yú)湯組、厄貝沙坦組腎小球截面積、腎小球體積及腎小管損害率小于模型組(P＜0.05)。見(jiàn)圖1。

2.3 腎皮質(zhì) MMP-2、TIMP-2表達(dá) MMP-2、TIMP-2表達(dá)主要定位于腎小管上皮細(xì)胞。與對(duì)照組比較，模型組 MMP-2、TIMP-2蛋白表達(dá)均降低，MMP-2/TIMP-2值降低(P＜0.05)。與模型組比較，鯉魚(yú)湯組、厄貝沙坦組MMP-2、TIMP-2表達(dá)上調(diào)，且MMP-2/TIMP-2升高(P＜0.05)，鯉魚(yú)湯組、厄貝沙坦組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

圖1 各組腎小球截面積、腎小球體積、腎小管損害率比較

表3 各組腎皮質(zhì)MMP-2、TIMP-2表達(dá)及MMP-2/TIMP-2 比較(OD 值，ˉx ±s)

3 討論

腎間質(zhì)纖維化、腎小球硬化是不同腎病終末期的共同形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，均是以ECM代謝失衡、異常堆積為病理基礎(chǔ)［7，8］。ECM的主要成分為Ⅳ型膠原，Ⅳ型膠原合成與降解失衡或多肽鏈結(jié)構(gòu)異?？墒笶CM過(guò)度蓄積，破壞GBM與TBM的正常結(jié)構(gòu)，使其喪失原有的結(jié)構(gòu)和功能，致蛋白尿產(chǎn)生，最終發(fā)展為纖維化乃至硬化。厄貝沙坦在治療腎病的臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)具有更強(qiáng)阻斷，更強(qiáng)降壓作用，對(duì)降低微量及大量蛋白尿，抑制氧化應(yīng)激，降低腎病終點(diǎn)事件發(fā)生率效果優(yōu)于氯沙坦、纈沙坦等藥物。本研究以厄貝沙坦為藥物對(duì)照，觀察鯉魚(yú)湯腎臟保護(hù)作用的療效，發(fā)現(xiàn)第5周～第9周，鯉魚(yú)湯組、厄貝沙坦組尿蛋白排泄率呈時(shí)間依賴性降低，BUN、Cr、尿蛋白明顯低于模型組，TP、ALB升高，鯉魚(yú)湯組、厄貝沙坦組尿蛋白排泄率、BUN、Cr、TP、ALB 的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示鯉魚(yú)湯亦具有利水消腫、減輕蛋白尿的作用，推測(cè)其機(jī)制可能為升高血漿膠體滲透壓，減少ECM的蓄積以維持GBM、TBM的完整性。

MMP-2是MMPs家族的重要成員，主要降解ECM成分中的Ⅳ型膠原。TIMP-2是其內(nèi)源性抑制劑，它們共同調(diào)節(jié)ECM的新陳代謝。MMP/TIMP是ECM維持穩(wěn)定性和完整性的決定性因素［9］。在腎病不同階段，MMP-2、TIMP-2的表達(dá)存在不同，腎病早期(出現(xiàn)纖維化前)MMP-2代償性表達(dá)上調(diào)，而腎病晚期出現(xiàn)硬化時(shí)MMP-2、TIMP-2表達(dá)均下調(diào)，ECM蓄積，導(dǎo)致腎小球系膜基質(zhì)堆積出現(xiàn)間質(zhì)纖維化［10，11］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組腎小球截面積、腎小球體積均較對(duì)照組增大，并出現(xiàn)纖維化及硬化，MMP-2、TIMP-2表達(dá)均降低，且 MMP-2/TIMP-2值降低，即MMP-2下調(diào)的程度超過(guò)TIMP-2的下調(diào)程度，TIMP-2相對(duì)高表達(dá)，提示模型組腎臟ECM合成增加;鯉魚(yú)湯組與厄貝沙坦組MMP-2、TIMP-2蛋白表達(dá)均有所上調(diào)，腎小球截面積、腎小球體積均較模型組減小，但二者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示應(yīng)用鯉魚(yú)湯后腎臟炎癥侵潤(rùn)、纖維化病理變化有所改善。

綜上所述，鯉魚(yú)湯具有腎臟保護(hù)作用。其機(jī)制可能是鯉魚(yú)魚(yú)肉或魚(yú)鱗中含有某種活性成分，參與了ECM降解酶系的某個(gè)作用環(huán)節(jié)，有利于調(diào)節(jié)MMP-2/TIMP-2的平衡以及濾過(guò)膜重建，從而減少ECM的蓄積并促進(jìn)其降解，緩解腎臟纖維化、硬化的進(jìn)程。鯉魚(yú)作為一種價(jià)格低廉、天然易獲得的食材，具有較大的藥用價(jià)值。

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