硫化氫對肝硬化大鼠門靜脈壓力及肝細胞增殖的影響

陳衛剛，鄭 勇，張 寧，閻繼攀，劉 浩，李 睿，齊翠花，宋麗秀

(1石河子大學醫學院第一附屬醫院，新疆石河子832008;2石河子大學醫學院)

內源性硫化氫(H2S)是具有擴張血管、抑制平滑肌細胞增殖和誘導細胞凋亡作用的氣體信號分子［1～3］。研究發現，H2S在肝硬化發生過程中起保護性調節作用，但具體機制尚不明確。增殖細胞核抗原(PCNA)是一種僅在增殖細胞中合成和表達的36 kD多肽，PCNA陽性表達說明該細胞處于增殖狀態［4］。2009年 1月 ～2011年 12月，我們觀察了H2S對肝硬化大鼠門靜脈壓力及肝細胞增殖的影響，探討H2S在肝硬化發生過程中的保護性作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 48只雌性SD大鼠均購自新疆維吾爾自治區醫學實驗動物研究中心。主要試劑及儀器:細胞胱硫醚γ裂解酶(CSE)小鼠抗大鼠多克隆一抗、PCNA兔抗大鼠多克隆一抗均購自abcam公司，二抗檢測試劑盒購自北京中杉金橋有限公司;RNA提取試劑TRIzol購自美國Invertrogen公司;M-MLV逆轉錄酶、Tap酶購自美國mentas公司;PCR引物及內參照GAPDH引物、real time熒光試劑盒由日本takers公司合成。丙基甘氨酸(PPG)購于Sigma公司，其余試劑為國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 肝硬化模型制備 將48只大鼠隨機分為正常對照組、正常H2S增加組、正常H2S減少組、肝硬化對照組、肝硬化H2S增加組、肝硬化H2S減少組，每組各8只。各肝硬化組采用四氯化碳(CCL4)復合因素法制備肝硬化模型:皮下注射40%CCL4(以棉子油稀釋)0.3 mL/100 g體質量(首次劑量0.5 mL/100 g)，每隔4天1次;高脂高膽固醇飼料及高脂飼料喂養，飲用水為15%乙醇。各正常組只給予相同劑量的棉子油，采用標準飼養法飼以復合飼料，飲用自來水。結果各肝硬化組均制模成功(肝組織體積縮小，重量減輕，質地變硬，顏色變淺，邊緣變鈍，表面出現大小不等的結節。正常肝小葉結構破壞，纖維結締組織增生，假小葉形成)。

1.2.2 內源性H2S干預 造模成功后，肝硬化H2S增加組及正常H2S增加組給予H2S供體硫氫化鈉(NaHS)56 μmol/(kg·d)腹腔注射以促進 H2S生成;肝硬化H2S減少組及正常H2S減少組給予同等劑量H2S代謝酶抑制劑PPG 30 mg/(kg·d)腹腔注射以抑制H2S生成;另兩組給予0.9%氯化鈉注射液l mL腹腔注射。各組均注射7 d。

1.2.3 觀察項目 ①門靜脈壓力:干預7 d后，各組均予乙醚麻醉，固定大鼠后開腹，靜脈留置針置于門靜脈主干，連接測壓裝置，測定門靜脈壓力。②肝組織病理學變化:測定門靜脈壓力后處死大鼠，觀察肝臟大體形態;取一塊肝組織置于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片，光鏡下觀察肝組織病理變化。③肝組織CSE及PCNA蛋白表達:采用免疫組化SP法，按SABC試劑盒說明書操作，PBS替代一抗作陰性對照。每張切片于高倍鏡下隨機選擇5個視野，以細胞呈棕黃色為陽性，每個視野記數200個細胞，共計1 000個細胞，計數CSE陽性細胞數。切片的觀察和計數均由病理科醫生完成。CSE定位于細胞質，PCNA定位于細胞核，陽性細胞可見細胞質或細胞核染為棕褐色或棕黃色。于染色分布均勻區域隨機取5個高倍鏡視野(400×)，計數500個細胞中的陽性細胞數，以平均每100個細胞中的陽性細胞數為標記指數(PI)，PI=［陽性細胞/500個細胞］×100%。④CSE及PCNA mRNA表達:采用PCR法檢測。取新鮮肝組織一塊置于液氮中速凍后轉移至－80℃冰箱保存，TRIzol法提取總RNA并以為模板進行逆轉錄。反應條件為42℃、1 h，92℃、2 min，總反應體系20 μL，所得 cDNA 于 －20 ℃保存。Icycler iQ實時定量PCR儀進行PCR反應，反應條件:95℃預變性10 s;94℃、30 s，60℃ 、30 s，72℃、30 s，其中 CSE 共 40個循環，PCNA 共45個循環，之后分別于83.5℃及91.5℃收集熒光。擴增反應結束后從55℃緩慢加熱到95℃(每10 s升高0.5℃)，建立PCR產物的融解曲線。根據繪制的梯度稀釋DNA標準曲線，由儀器生成各標本目的基因和參照基因的原始循環數。由于目的基因和參照基因擴增效率均接近100%且相互間效率偏差較小，故采用Livak法計算mRNA表達量(CT值)。1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件，數據以ˉx±s表示，計量資料組間比較采用單因素方差分析，計數資料組間比較采用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 門靜脈壓力 正常對照組、正常H2S減少組、正常H2S增加組、肝硬化對照組、肝硬化H2S減少組、肝硬化H2S增加組、門靜脈壓力分別為(9.78±1.12)、(9.16 ± 1.17)、(8.79 ± 1.18)、(14.13 ±0.56)、(15.99 ±1.21)、(13.76 ±1.28)mmHg。肝硬化的三組均高于正常對照組(P均＜0.01);肝硬化H2S減少組明顯高于肝硬化對照組(P＜0.01);肝硬化H2S增加組明顯低于肝硬化對照組(P＜0.01)。

2.2 CSE及PCNA蛋白表達 見表1。

2.3 CSE及PCNA mRNA表達 見表2。

3 討論

研究發現，H2S在多系統疾病中均發揮保護性作用，且該作用與其對細胞增殖的調節有關［5，6］。本課題組前期研究表明，H2S不僅具有顯著的擴血管效應，還對肝硬化有保護作用，CSE-H2S體系下調是門脈高壓癥血管結構重建的重要原因之一［7，8］。本研究肝硬化大鼠門靜脈壓力明顯高于正常大鼠，H2S供體增加體內H2S含量后門靜脈壓力降低;而給予H2S抑制劑后門靜脈壓力進一步升高，提示H2S可降低門靜脈壓力，而H2S缺乏則可加重門靜脈高壓。進一步證實H2S在肝硬化的發生發展過程中具有保護性作用［7～9］。CSE是體內的主要代謝酶之一，主要在肝臟和血管以及非血管平滑肌中表達，通過代謝含硫的氨基酸如半胱氨酸、甲硫氨酸和同型半胱氨酸等生成H2S，我們的前期研究表明，肝硬化大鼠CSE表達明顯高于CBS，且肝硬化時H2S/CSE體系下調，而廖家智等［10］則認為肝硬化門脈高壓時H2S/CSE體系上調。本研究顯示，肝硬化大鼠CSE表達明顯降低，表明肝硬化時H2S/CSE體系下調。肝硬化大鼠NaHS干預后CSE表達升高，上調H2S/CSE體系，給予H2S代謝酶抑制劑PPG干預后其表達明顯降低，此與課題組前期研究結果一致。再一次證實了肝硬化時大鼠肝組織內H2S/CSE體系下調，而H2S供體可上調H2S/CSE體系，H2S代謝酶抑制劑可下調H2S/CSE體系。

表1 各組PCNA、CSE蛋白表達(ˉx±s)

表2 各組 PCNA、CSE mRNA(CT 值，ˉx ±s)

各種損傷因素持續作用于肝臟可引起肝星狀細胞激活，進而引起細胞外基質生成與降解的失衡，以Ⅰ型和Ⅲ型膠原的生成增多為主要表現。研究表明，外源性H2S可抑制肺動脈平滑肌細胞增生，減少肺動脈組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白合成，緩解缺氧狀態下肺血管結構重建。PCNA是一項評估細胞增殖的指標。本研究發現，肝硬化大鼠給予H2S供體增加體內H2S含量后，肝組織內PCNA表達降低，提示H2S具有抑制肝細胞增殖作用，可致肝星狀細胞和肝細胞合成膠原能力降低，進而可引起膠原合成降低、延緩肝硬化的進展;給予H2S代謝酶抑制劑后，肝硬化大鼠肝組織內PCNA表達升高，提示H2S缺乏可促進肝細胞增殖，無論是肝細胞還是肝星狀細胞增殖均可引起膠原合成增多，進而加重膠原代謝的紊亂狀態，促進肝硬化進展。

肝竇是調節肝臟微循環及門靜脈血流量的重要結構，其收縮和擴張影響著肝臟血流量的大小和門靜脈壓變化［11］。肝硬化發生時，大量膠原蛋白堆積于肝竇，引起竇性門靜脈循環受阻，進而引起門靜脈壓力升高。本研究發現，肝硬化大鼠H2S增加體內H2S含量后門靜脈壓力降低，而降低H2S后可進一步加重門脈高壓，提示H2S可通過調節肝細胞增殖進而影響膠原蛋白生成，調節肝硬化時門靜脈的壓力，在肝硬化的發生發展過程中對肝臟起保護性作用。

綜上所述，氣體信號分子H2S在肝硬化發生發展過程中具有保護性作用，其機制與其對肝組織內細胞增殖的調節有關。關于H2S是通過抑制肝細胞還是肝星狀細胞發揮作用，或對兩種細胞的增殖均有作用，有待進一步研究證實。

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