星形膠質細胞瘤組織中NGF和TrkA表達及臨床意義

尹 宏，永 勝，趙海龍，黃 欣

(青海大學醫學院病理教研室，西寧810001)

膠質瘤是顱內最常見的腫瘤，具有發病率高、復發率高、病死率高和治愈率低的特點，由于其呈侵襲性生長，術后極易復發，且復發的膠質瘤有惡性轉化的特征，使得膠質瘤一直是神經外科治療的重點和難點。星形膠質細胞瘤是最常見的膠質瘤，占膠質瘤的78%以上，根據腫瘤細胞的分化程度和增殖潛能等可分成4個不同的等級［1］，通常認為Ⅰ～Ⅱ級屬于低度惡性，Ⅲ～Ⅳ級則屬于高度惡性。2010年1月～2012年6月，我們檢測了神經生長因子(NGF)及其受體酪氨酸蛋白激酶A(TrkA)在人腦星形膠質細胞瘤組織中的表達，旨在進一步探討兩者在人腦星形膠質細胞瘤發生、發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 選取青海大學附屬醫院神經外科手術切除的腦星形膠質細胞瘤組織標本48份(膠質瘤組)，按WHO病理分級法Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級各12份。患者男28例，女20例;年齡30～70歲;≤50歲30例，＞50歲18例。所有患者均經病理證實診斷，且術前均未接受化療、放療或其他針對腫瘤的治療。取瘤旁正常腦組織48份(正常組)作對照。兩組一般資料無統計學差異。主要試劑:兔抗NGF和TrkA多克隆抗體(一抗)(美國CHEMICON);SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司);逆轉錄—聚合酶鏈反應試劑盒(TaKaRa公司);DNA2000(上海生工公司);瓊脂糖(大連寶生物公司);引物采用Primer Premier5.0軟件設計，由大連寶生物公司合成。

1.2 NGF和TrkA蛋白表達檢測 采用免疫組化SP法。標本常規包埋、切片，DAB棕色呈色，陰性對照用PBS代替一抗，其余均照說明書操作。NGF和TrkA蛋白陽性判斷標準:高倍鏡下隨機選擇10個視野，每個視野至少記數100個細胞，按每一切片陽性細胞比例及染色強度計分，采用半定量積分法。膠質瘤組NGF蛋白陽性著色定位于細胞質和細胞核，正常組NGF蛋白陽性著色主要定位于細胞質，兩組TrkA蛋白陽性著色定位于細胞膜和細胞質，以出現棕黃色顆粒者為陽性細胞。陽性細胞＜5%為0分，5% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，＞75%為4分。染色強度:無著色或與背景均勻一致的淡黃色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項計分乘積為0～1分判為陰性，2～4分為+，5～7分為++，＞7分為+++;+～+++為陽性。

1.3 NGF和TrkA mRNA檢測 采用RT-PCR法。取出凍存的新鮮標本(兩組均為100 mg)，Trizol法提取組織總RNA，測定總RNA濃度及純度。以下均嚴格按照說明書操作。PCR產物于15 g/L的瓊脂糖凝膠做電泳，以無菌水代替cDNA模板的PCR管為陰性對照，天能凝膠成像系統對電泳條帶拍照并進行半定量分析。NGF及TrkA mRNA相對表達量以同一反應體系中目的產物電泳條帶密度指數與內參對照β-actin電泳條帶密度指數的比值表示。

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件，計量資料以ˉx±s表示，采用t檢驗;計數資料行χ2檢驗。RT-PCR結果與免疫組化結果的相關性采用Spearman等級相關分析。α=0.05。

2 結果

2.1 NGF和TrkA蛋白表達 膠質瘤組及正常組NGF蛋白表達陽性率分別為77%、31%，TrkA蛋白表達陽性率分別為85%、43%，兩組比較P均 ＜0.05。

2.2 NGF和TrkA mRNA表達 膠質瘤組及正常組NGF mRNA的相對表達量分別為0.78±0.19、0.41 ±0.12，TrkA mRNA 的相對表達量分別為0.83±0.04、0.51 ±0.13，兩組比較，P 均 ＜0.05。

2.3 NGF和TrkA表達與星形膠質瘤臨床病理參數的關系 見表1。

表1 NGF和TrkA表達與星形膠質瘤臨床病理參數的關系

2.4 NGF與TrkA表達的相關性 膠質瘤組NGF、TrkA蛋白和NGF、TrkA mRNA表達均呈正相關(r=0.805，P ＜0.01)。

3 討論

NGF是神經營養素(NTs)家族中的一員，由神經系統的星狀細胞、少突神經膠質細胞合成，通過旁分泌途徑調控神經元分化、生存、凋亡及突觸調制，調節神經細胞生長、分化、存活和成熟的糖蛋白［2］。TrkA屬于酪氨酸激酶受體家族中的一種跨膜糖蛋白，NGF的生物學效應主要由TrkA介導［3］。NGF與高親和力受體TrkA結合使TrkA空間結構改變，受體胞內段的酪氨酸激酶結構域被激活，發生受體自身磷酸化，通過PI3K-Akt，Ras-MAPK和PLcY通路介導發揮神經營養活性。有文獻報道，神經膠質細胞惡變產生的腫瘤細胞(如星形膠質瘤、膠質母細胞瘤以及神經母細胞瘤細胞等)也可以分泌NGF［4］;膠質瘤組織高表達 NGF 及 TrkA［5］。亦有報道，TrkA表達可以促進膠質瘤細胞增殖［6］。NGF可促進膠質母細胞瘤細胞株的有絲分裂，這一作用可以被TrkA磷酸化抑制劑K252a劑量依賴性的抑制，說明NGF對膠質母細胞瘤細胞株的促增殖作用是通過激活TrkA的磷酸化起作用的［7］。但有報道在兒童星形膠質細胞瘤的研究中NGF及TrkA呈低表達［8］。Hansen等［9］的研究認為 NGF 可以誘導轉TrkA基因的G55膠質瘤細胞發生不依賴Caspase激活的自體吞噬死亡過程，說明NGF可以通過多種途徑對膠質瘤產生抑制作用。以上關于NGF及TrkA在膠質瘤中的表達及對膠質瘤細胞生物學作用的報道存在顯著差異，可能與所選取研究對象NGF及TrkA的基礎表達水平及分布模式有關。

本研究膠質瘤組NGF和TrkA蛋白、TrkA mRNA表達均明顯高于正常組，提示NGF和TrkA可能參與了星形膠質細胞瘤的發生。本研究還發現，NGF和TrkA蛋白、TrkA mRNA表達與星形膠質細胞瘤病理分級相關，且隨惡性程度增高而增加，提示NGF和TrkA在星形膠質細胞瘤細胞內表達水平與星形膠質細胞瘤病理級別有密切關系，NGF和TrkA高表達在星形膠質細胞瘤的發生發展過程中可能起促進作用。

總之，NGF和TrkA的表達可反映星形膠質細胞瘤的生物學行為，可作為判斷星形膠質細胞瘤惡性程度和預后的有價值的指標。

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