γ-分泌酶抑制劑對(duì)姜黃素后處理心肌保護(hù)作用的影響

王 寧，段維勛，楊 陽，李 悅，梁振興，金振曉，易定華，俞世強(qiáng)

(1第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院，西安710032;2第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)系)

藥物干預(yù)是對(duì)抗心肌缺血/再灌注損傷(IR)的重要策略和主要研究方向。但I(xiàn)R是由多種信號(hào)通路和細(xì)胞因子參與的復(fù)雜過程［1］，由于具體作用機(jī)制、藥物來源、副作用和倫理學(xué)等諸多問題，至今未能獲得理想的心肌保護(hù)藥物［2］。姜黃素(Curcumin，Cur)具有多重心血管保護(hù)作用，且毒性作用小、經(jīng)濟(jì)、安全，是當(dāng)前心肌IR研究領(lǐng)域極具研究價(jià)值和開發(fā)前景的中藥［3］。我們前期研究顯示，Cur后處理可有效對(duì)抗心肌IR損傷，但其機(jī)制尚未完全闡明［4］。2012年6～10月，我們觀察了 γ-分泌酶抑制劑DAPT(Notch信號(hào)通路特異性阻斷劑)對(duì)Cur后處理心肌保護(hù)作用的影響，探討Notch信號(hào)通路在Cur后處理在抗心肌IR中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 動(dòng)物:成年SD大鼠40只，雄性，體質(zhì)量220～250 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。主要試劑和儀器:DAPT(Santa Cruz公司，美國)，2，3，5-氯三苯四唑(Sigma公司，美國)，LDH檢測(cè)試劑盒(南京建成公司，中國)。GAPDH小鼠抗大鼠多克隆抗體(中杉金橋生物技術(shù)有限公司，北京)，兔抗大鼠Notch1多克隆抗體(Abcom公司，美國)，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔或鼠IgG(中杉金橋生物技術(shù)有限公司，北京)，BCA-100蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒(Pierce公司，美國)，組織裂解蛋白提取液(碧云天生物技術(shù)公司，上海)，蛋白酶抑制劑(Sigma公司，美國)，預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker(Fermentas公司，美國)。Langendoff離體心肌灌注系統(tǒng)(Radnoti公司，美國)，MP100壓力換能器(Biopac Systems公司，美國)，電泳及濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移槽(Bio-Rad公司，美國)，Western發(fā)光照相系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 離體心臟灌注模型建立及干預(yù) 根據(jù)文獻(xiàn)［4］，Langendoff系統(tǒng)采用經(jīng)典的 KH 液灌裝，KH緩沖液成分(mmol/L):NaCl 118，KCl 4.7，CaCl21.25，MgSO41.2，KH2PO41.2，NaHCO325，葡萄糖5.5。灌流前50 min，以體積分?jǐn)?shù)為95%的 O2和5%的CO2混合氣體向儲(chǔ)液罐內(nèi)的灌流液中持續(xù)通氣，灌流液溫度維持在37℃，維持pH 7.35～7.45。SD大鼠腹腔注射戊巴比妥(30 mg/kg)和肝素(500 U/kg)后麻醉，迅速開胸取心臟，立即放入預(yù)冷的KH緩沖液(4℃)。將主動(dòng)脈根部迅速固定于灌注管口，于37℃下用KH液逆行恒壓灌注(灌注壓為80 mmHg)。心臟復(fù)跳后，于左心耳處剪一小口，將帶有乳膠水囊的測(cè)壓管經(jīng)二尖瓣插入左心室。連接壓力換能器，調(diào)節(jié)水囊使左心室舒張末壓至5～10 mmHg，心臟穩(wěn)定灌注10 min、待心跳穩(wěn)定后按分組進(jìn)行灌注。

將40只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、IR組、Cur組、Cur+DAPT組、DAPT組各8只。各組均采用離體心臟Langendoff逆行灌注10 min致心肌缺血，停止灌注30 min后除對(duì)照組外其余各組均予KH液再灌注150 min。Cur組再灌注液中含1 μM的Cur，Cur+DAPT 組含有 1 μM 的 Cur 和 0.5 μM 的DAPT，DAPT 組含有0.5 μM 的 DAPT。

1.2.2 觀察項(xiàng)目

1.2.2.1 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo) 采用MP100換能器記錄心臟缺血前10 min(以下稱為缺血前)及再灌注15、30、45 及 60 min(以下分別以 R15、R30、R45、R60表示)時(shí)的心率(HR)、左心室發(fā)展壓(LVDP)、左心室內(nèi)壓最大變化速率(+dp/dtmax)。收集上述時(shí)間點(diǎn)的冠脈流出液，記錄冠脈流量(CF)。

1.2.2.2 心肌梗死面積(MI面積) 采用TTC染色法測(cè)定。參照文獻(xiàn)［4］，心臟處理完畢后于－70℃冷凍10 min，繼之沿心臟長軸切成橫切面1～2 mm的切片，每個(gè)心臟取直徑最長的一片。切片在TTC及0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中孵育30 min(pH調(diào)整至7.4，溫度37℃)，再置于40 g/L的甲醛中固定過夜，并行數(shù)碼攝影。用linageJ1.37軟件行圖像分析，磚紅色區(qū)域?yàn)檎^(qū)域，灰白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ绤^(qū)域。MI面積由總壞死區(qū)占總切片區(qū)的百分比表示。

1.2.2.3 冠脈流出液 LDH 水平 根據(jù)文獻(xiàn)［4］所述，留取各組R15時(shí)的冠脈流出液，LDH檢測(cè)試劑盒檢測(cè)流出液LDH水平，嚴(yán)格按照說明書操作。

1.2.2.4 心肌組織Notch1表達(dá) 采用Western blot法測(cè)定。將留取的心肌組織在裂解緩沖液中勻漿裂解，以12 000 r/min離心15 min。收集組織裂解物，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取20 μg總蛋白于1×SDS緩沖液中煮7 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳并電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜用含50 g/L脫脂奶粉的TBST室溫封閉1.5 h，依次滴加1∶1 000的抗Notch1及GAPDH抗體，4℃過夜后TBST洗滌3次，每次10 min。用1∶5 000的 HRP-羊抗兔或鼠IgG孵育2 h，再用TBST洗滌3次，每次10 min。最后用ECL發(fā)光液進(jìn)行曝光顯影，Bio-Rad照相系統(tǒng)進(jìn)行照相和并用其附帶的軟件分析蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以ˉx±s表示。差異顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，組間差異采用LSD-t法檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo) 與IR組比較，DAPT組各時(shí)間點(diǎn)LVDP、+dp/dtmax均明顯降低(P＜0.01);與對(duì)照組比較，DAPT組加藥10 min內(nèi)心率減慢，而LVDP、+dp/dtmax升高(P ＜0.01)，藥物去除后，LVDP和+dp/dtmax逐漸恢復(fù)到正常水平，各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組缺血前后相關(guān)指標(biāo)比較見表1。

2.2 MI面積 各組MI面積比較見圖1。

2.3 冠脈流出液LDH水平 Cur組明顯低于IR組(P＜0.01);Cur+DAPT組明顯高于 Cur組(P＜0.01);DAPT組與IR組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見圖2。2.4 心肌組織Notch1蛋白表達(dá) Cur組明顯高于IR組(P＜0.01);Cur+DAPT組明顯低于Cur組(P＜0.01);DAPT組明顯低于 IR 組(P ＜0.01)，見圖3。

表1 各組心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較(n=8，ˉx±s)

3 討論

缺血性心臟病治療的核心是重新恢復(fù)心肌血液供應(yīng)，但缺血心肌組織重新恢復(fù)血供(再灌注)后常繼發(fā)和加重心肌組織損傷，即心肌IR［1］，常導(dǎo)致患者死亡、預(yù)后不良、嚴(yán)重并發(fā)癥發(fā)生。心肌IR的病理機(jī)制復(fù)雜，很多信號(hào)通路和細(xì)胞因子參與其中［1，11～13］。

研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)通路在心血管系統(tǒng)發(fā)生、發(fā)育、病理和生理過程中發(fā)揮重要作用［5］，可能在心肌梗死后心肌保護(hù)中發(fā)揮調(diào)控作用［6，7］;Cur可通過Notch信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［8～10］。藥物后處理是對(duì)抗心肌IR的有效方法［14，15］。Cur是從 Cur科、Cur屬植物的根莖中提取的一種天然有效成分，分子式為C21H20O6，毒性作用小，安全范圍大［16］。Cur具有抗氧化、抗感染、抗炎、抗凝、降血脂、抗心力衰竭、抗心肌肥厚及抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種心血管效應(yīng)，且毒性作用小、經(jīng)濟(jì)、安全，尤其是其具有明確的抗IR、保護(hù)心肌作用極具研究價(jià)值和開發(fā)前景的中藥［17，18］。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，Cur后處理可以有效拮抗心肌IR損傷，但具體機(jī)制尚未完全闡明。

圖1 各組MI面積比較

圖2 各組冠脈流出液中LDH水平比較

圖3 各組心肌組織Notch1蛋白表達(dá)比較

有報(bào)道，心梗后晚期Notch信號(hào)通路關(guān)鍵分子NICD(Notch-1分子胞內(nèi)區(qū))在心梗邊緣區(qū)(缺血但未壞死，可獲得有效再灌注)表達(dá)顯著上升，即Notch信號(hào)通路激活后心功能得到顯著改善，提示Notch信號(hào)通路激活可能在心肌IR修復(fù)中發(fā)揮重要調(diào)控作用，且與其它信號(hào)通路通過復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生交互作用［19］。本研究得到了相同結(jié)果;同時(shí)發(fā)現(xiàn)激活Notch通路有明確的抗心肌IR作用，其對(duì)于抗凋亡相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)有重要調(diào)控作用［20～22］;提示Notch信號(hào)通路作為重要物質(zhì)基礎(chǔ)參與了調(diào)控心肌的IR過程，激活Notch信號(hào)通路具有抗心肌IR作用。本研究發(fā)現(xiàn)，Notch通路在心肌急性IR過程中被抑制，而心梗晚期Notch通路活化參與損傷修復(fù)過程。進(jìn)一步證實(shí)Notch信號(hào)通路可能在心肌梗死后的心肌保護(hù)中發(fā)揮調(diào)控作用［23］。研究顯示，Cur可通過Notch信號(hào)通路抑制食管腫瘤、口腔腫瘤和胰腺腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［8～10］;因此本實(shí)驗(yàn)觀察了 DAPT對(duì) Cur后處理心肌保護(hù)作用的影響。LDH廣泛存在于心肌細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)，細(xì)胞內(nèi)酶釋放到細(xì)胞外，使血清酶升高，故LDH水平可作為判斷心肌損傷程度的一項(xiàng)重要指標(biāo)［12，19］。本研究結(jié)果顯示，Cur后處理可改善心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，減小MI面積，降低冠脈流出液中LDH釋放量。DAPT作為Notch信號(hào)通路的特異性阻斷劑可消除Cur后處理對(duì)心肌IR的保護(hù)作用，表現(xiàn)為心臟血流動(dòng)力學(xué)減弱、MI面積增加、冠脈流出液中LDH釋放量增加。由此我們推測(cè):Notch信號(hào)通路參與介導(dǎo)了Cur后處理抗心肌IR作用，其調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究為Notch信號(hào)通路參與藥物后處理心肌保護(hù)作用提供了理論依據(jù)，有利于尋找全新的藥物作用靶點(diǎn)對(duì)心肌IR的主要作用環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)，對(duì)于獲得全新的心肌保護(hù)方法提供了新的思路。

［1］Botker HE，Kharbanda R，Schmidt MR，et al.Remote ischaemic conditioning before hospital admission，as a complement to angioplasty，and effect on myocardial salvage inpatients with acute myocardial infarction:a randomised trial［J］.Lancet，2010，375(9716):727-734.

［2］Kleinbongard P，Schulz R，Heusch G，et al.TNFα in myocardial ischemia/reperfusion，remodeling and heart failure［J］.Heart Fail Rev，2011，16(1):49-69.

［3］楊陽，段維勛，金振曉，等.姜黃素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞過氧化氫損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究［J］.中國體外循環(huán)雜志，2011，9(4):239-242.

［4］Duan W，Yang Y，Yan J，et al.The effects of curcumin posttreatment against myocardial ischemia and reperfusion by activation of the JAK2/STAT3 signaling pathway［J］.Basic Res Cardiol，2012，107(3):1-12.

［5］楊陽，段維勛，周京軍，等.γ-分泌酶抑制劑對(duì)正常乳鼠心肌細(xì)胞的影響［J］.中國體外循環(huán)雜志，2011，9(2):89-92.

［6］Mohamed Nemir，Thierry Pedrazzini.Functional role of Notch sig-naling in the developing and postnatal heart［J］.J Mol Cell Cardiol，2008，45(4):495-504.

［7］Qie E，Sandberg WJ，Ahmed MS，et al.Activation of Notch signaling in cardiomyocytes during post-infarction remodeling［J］.Scand Cardiovasc J，2010，44(6):359-366.

［8］Subramaniam D，Ponnurangam S，Ramamoorthy P，et al.Curcumin induces cell death in esophageal cancer cells through modulating Notch signaling［J］.PLoS One，2012，7(2):e30590.

［9］Liao S，Xia J，Chen Z，et al.Inhibitory effect of curcumin on oral carcinoma CAL-27 cells via suppression of Notch-1 and NF-κB signaling pathways［J］.J Cell Biochem，2011，112(4):1055-1065.

［10］Wang Z，Zhang Y，Banerjee S，et al.Notch-1 down-regulation by curcumin is associated with the inhibition of cell growth and the induction of apoptosis in pancreatic cancer cells［J］.Cancer，2006，106(11):2503-2513.

［11］Gude NA，Emmanuel G，Wu W，et al.Activation of Notch-mediated protective signaling in the myocardium［J］.Circ Res，2008，102(9):1025-1035.

［12］Wang N，Min X，Li D，et al.Geranylgeranylacetone protects against myocardial ischemia and reperfusion injury by inhibiting high-mobility group box 1 protein in rats［J］.Mol Med Report，2012，5(2):521-524.

［13］Huffmyer J，Raphael J.Physiology and pharmacology of myocardial preconditioning and postconditioning［J］.Semin Cardiothorac Vasc Anesth，2010，13(1):5-18.

［14］Takada Y，Hashimoto M，Kasahara J，et al.Cytoprotective effect of sodium orthovanadate on ischemia/reperfusion-induced injury in the rat heart involves Akt activation and inhibition of fodrin breakdown and apoptosis［J］.J Pharmacol Exp Ther，2004，311(3):1249-1255.

［15］Maulik SK，Seth SD，Manchanda SC，et al.Effect of verapamil post-treatment in myocardial reperfusion injury［J］.Indian J Exp Biol，1993，31(2):120-124.

［16］Wang L，Li C，Guo H，et al.Curcumin inhibits neuronal and vascular degeneration in retina after ischemia and reperfusion injury［J］.PLoS One，2011，6(8):e23194.

［17］Fiorillo C，Becatti M，Pensalfini A，et al.Curcumin protects cardiac cells against ischemia-reperfusion injury:effects on oxidative stress，NF-kappaB，and JNK pathways［J］.Free Radic Biol Med，2008，45(6):839-846.

［18］Weissenberger J，Priester M，Bernreuther C，et al.Dietary curcumin attenuates glioma growth in a syngeneic mouse model by inhibition of the JAK1，2/STAT3 signaling pathway［J］.Clin Cancer Res，2010，16(23):5781-5795.

［19］Zhang L，Ma J，Liu H.Protective effect of ischemic postconditioning against ischemia reperfusion-induced myocardium oxidative injury in IR rats［J］.Molecules，2012，17(4):3805-3817.

［20］Gude NA，Emmanuel G，Wu W，et al.Activation of Notch-mediated protective signaling in the myocardium［J］.Circ Res，2008，102(9):1025-1035.

［21］楊陽，段維勛，梁振興，等.Jagged1蛋白對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的作用［J］.中國體外循環(huán)雜志，2012，10(4):43-46.

［22］楊陽，段維勛，梁振興，等.γ-分泌酶抑制劑對(duì)大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的作用［J］.中國體外循環(huán)雜志，2012，10(4):249-252.

［23］楊陽，段維勛，金振曉，等.缺血/再灌注前后人心肌組織中Notch信號(hào)通路相關(guān)分子的變化［J］.中國體外循環(huán)雜志，2010，9(12):235-237.

［24］Ahmed I，Chandrakesan P，Tawfik O，et al.Critical roles of Notch and Wnt/β-catenin pathways in the regulation of hyperplasia and/or colitis in response to bacterial infection［J］.Infect Immun，2012，80(9):3107-3121.