結核性胸膜炎患者外周血miR-365a-3p、miR-29a-3p的表達及意義

張 帆，劉守江，魏 巍，張國良，陳心春，周伯平，王 健

(1.深圳市南山區慢性病防治中心結核病防治科，廣東 深圳 518054；2.深圳市第三人民醫院，廣東 深圳 518112)

結核性胸膜炎是由結核菌及其代謝產物進入高度過敏狀態的機體胸膜腔而引起的胸膜炎癥，占結核性疾病的4%，我國胸腔積液患者中超過一半是有結核性胸膜炎引起。結核性胸膜積液如果未能及時診斷與治療，會造成胸膜肥厚粘連，限制性肺功能下降。結核性胸膜炎的診斷仍是目前臨床難題之一，缺乏有效、客觀、可靠的方法。近年來的研究表明，微小RNA(microRNA，miRNA)在人體內發揮重要的生物學作用，其是一類高度保守的非編碼單鏈小RNA，近1/3的人類基因表達受miRNA調控，涉及細胞增殖、分化、凋亡等多個過程，miRNA表達異常可導致一些疾病的發生[1-2]。研究顯示，miRNA可能參與肺結核病的發生和發展。本研究著重要進一步探討miRNA在結核性胸膜炎患者中的表達及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年6～11月在我院就診的結核性胸膜炎患者30例，年齡17～43歲，平均27歲，其中男性16例，女性14例；所有患者根據病史、體征、X線、超聲和胸腔積液檢查[3]診斷。無膿胸產生，無慢性肺病，無心、肝、腎等臟器合并癥及其他感染，無糖尿病、腫瘤等免疫相關性或免疫性疾病；均暫未接受過激素及免疫抑制劑、抗生素及抗結核治療。同時選取與病例組年齡、性別匹配的30例健康者為對照組。本研究經深圳市南山區慢性病防治院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣本采集 采集兩組研究對象的外周血5 ml，肝素鋰抗凝，標本采集后30 min內，分裝200 μl全血于已預裝有Trizol和研磨珠的凍存管中，振蕩器振蕩混勻，-80℃保存。

1.2.2 miRNA提取 采用Invitrogen公司Trizol Reagent試劑盒抽提全血中總RNA，適量無RNase水充分溶解總RNA。采用核酸測定儀測定濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳分析RNA完整性良好；調整RNA濃度，于-80℃保存。

1.2.3 逆轉錄miRNA 取總RNA 1 μl，2×反轉錄緩沖混合物10 μl，RNase Free水5 μl，反轉錄酶2 μl，0.1%BSA 2μl。37℃ 60 min，85℃ 5 min，4℃ 5 min。逆轉錄成cDNA放置-20℃保存備用。

1.2.4 熒光定量PCR 擴增方法參照熒光定量PCR試劑盒(Takara公司)，分別取SYBR Green 12.5 μl，待測樣品 cDNA 2 μl，上游引物 1 μl，下游引物 1 μl，水 8.5 μl，總體積25 μl。引物由invitrogen公司合成，引物序列：miR-365a-3p：5'-GCGCTAATGCCCCTAAAAATCCTT-3'；miR-29aL-3p：5'-CGTAGCACCAT CTGAAATCGGTT-3'；下游引物為通用引物；U6：TAKARA公司產品，Code：D356-03，Lot：B101B；。擴增條件：預變性95℃ 10 s；變性和延伸95℃ 5 s；60℃ 20 s，共40個循環。采用熒光定量PCR中的相對定量法，以管家基因U6作為內參，以2-△△Ct表示miRNA相對表達量，具體計算方法如下，待測miRNA的Ct值減去U6的Ct值，獲得各樣本中待測miRNA的△Ct值，然后采用實驗組miRNA的△Ct值減去健康對照組的△Ct，獲得△△Ct，最后計算miRNA相對表達量 2-△△Ct。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，兩組間外周血miR-365a-3p和miR-29a-3p的表達差異比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組外周血miR-365a-3p的表達 結核性胸膜炎組患者外周血miR-365a-3p表達(0.66±0.60)明顯高于健康對照組(0.33±0.29)，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 外周血miR-365a-3p在結核性胸膜炎患者和健康對照組中的表達

2.2 兩組外周血miR-29a-3p的表達 結核性胸膜炎組患者外周血miR-29a-3p表達(0.74±0.65)與健康對照組(0.75±0.31)相似，差異無統計學意義(P＞0.05)，見圖2。

圖2 外周血miR-29a-3p在結核性胸膜炎患者和健康對照組中的表達

3 討論

結核性胸膜炎發病率高，在肺外結核中僅次于淋巴結核，其確診主要依賴于痰、胸腔積液、胸膜活檢檢出結核桿菌或發現結核性肉芽腫，臨床上結核性胸膜炎常規檢查方法效率低，及時準確地診斷結核性胸腔積液仍存在較多困難。隨著新研究新技術的迅速發展，生物學指標在結核性胸膜炎的輔助診斷中起到重要作用，特別是近年來研究發現miRNA分子與一些疾病的發生、發展息息相關。而在我們的研究中發現結核性胸膜炎患者外周血miR-365a-3p表達明顯高于健康對照組，miR-29a-3p表達在兩組之間差異無統計學意義。

Xu等[4]研究發現miR-365a可能在機體炎癥反應中起到重要作用，miR-365a與細胞炎癥因子IL-6表達相關，miR-365a可通過直接與IL-6基因的調控區域結合，負性調節IL-6 mRNA表達，從而抑制IL-6蛋白生成，miR-365a還可能通過非直接途徑抑制IL-6表達，而且其調控IL-6的能力超過let-7a。在我們的研究中也發現結核性胸膜炎患者外周血miR-365a-3p表達明顯升高，其可能參與了結核性胸膜炎炎癥反應的發生。

miR-29a除在抗纖維化中起到重要作用外，在機體免疫應答反應中也起到重要作用，miR-29a可通過靶向降解IFN-γ降低機體對胞內病原體的免疫應答，伊正君等[6]研究發現活動性肺結核患者痰液中miR-29a的表達相對于正常人明顯升高，可能在抗結核桿菌感染的過程中發揮著重要作用。但在我們的研究中并未發現結核性胸膜炎患者外周血miR-29a的表達與正常人之間的差異，其可能與樣本量相對較少有關，具體還需進一步分析。

綜上所述，我們的研究發現結核性胸膜炎患者外周血miR-365a-3p表達明顯升高，其可能參與了結核性胸膜炎炎癥反應的發生，具體作用仍待進一步研究。同時，檢測外周血miR-365a-3p水平結合其他診斷方法，可能能提高結核性胸膜炎的診斷率。

[1]Calin GA,Ferracin M,Cimmino A,et al.A MicroRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia[J].N Engl J Med,2005,353(17)：1793-801.

[2]孫華麟.miRNA在類風濕關節炎中的研究進展[J].海南醫學,2012,23(8)：126-128.

[3]業秀林,郝青林.結核性胸膜炎診斷和治療進展[J].實用心腦肺血管病雜志,2009,17(1)：75-77.

[4]Xu Z,Xiao SB,Xu P,et al.miR-365,a novel negative regulator of interleukin-6 gene expression,is cooperatively regulated by Sp1 and NF-kappaB[J].J Biol Chem,2011,286(24)：21401-21412.

[5]伊正君,付玉榮,李瑞芳,等.活動性肺結核患者痰液中miR-29a的表達[J].中華微生物學和免疫學雜志,2012,32(4)：333-334.