五味子乙素聯(lián)合順鉑對H22腫瘤小鼠的抑瘤作用

范曉艷 呂冬霞 姚海濤 金岳雷 (佳木斯大學基礎醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154007)

隨著細胞凋亡研究的不斷深入，誘導細胞凋亡的藥物也不斷被發(fā)現(xiàn)，同時藥物誘導腫瘤細胞凋亡機制的研究更成為研究的熱點。五味子乙素(schisandrin B，SchB)系木蘭科植物五味子的干燥成熟果實的提取物，劉力生等〔1〕研究顯示SchB對小鼠免疫功能、腹水型肝癌細胞DNA合成具有抑制作用。順鉑是一種類烷化劑的金屬鉑類化合物，為常用的化療藥物。本實驗將SchB與順鉑聯(lián)合作用于H22小鼠實體瘤，觀察兩者聯(lián)合作用后p53的表達變化。

1 材料與方法

1.1 材料 SohB成都巨邦生物工程有限公司惠贈;順鉑:中國山東省德州制藥廠，批號20070516;實驗瘤源小鼠:H22腹水瘤小鼠購于哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院動物中心;實驗動物:昆明種近交系小鼠，體重(20±2.0)g，雄性，佳木斯大學實驗動物中心提供，許可證號:黑動字第99101001，普通級，普通環(huán)境飼養(yǎng)。p53免疫組化試劑盒:武漢博士德生物公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組與用藥 將接種H22瘤種8 d的腹水瘤小鼠以脫頸法處死，無菌條件下抽取腹水瘤細胞懸液5 ml，經(jīng)離心稀釋，用生理鹽水重新懸浮細胞，細胞懸液濃度為1×1010/L。以0.2 ml/只接種于被試的40只昆明種小鼠右腋下，制成實體瘤動物模型。于接種24 h后，將40只被試小鼠隨機分成4組:單純順鉑組、單純SchB組、SchB聯(lián)合順鉑組(以下簡稱聯(lián)合組)和對照組。順鉑用生理鹽水溶解后按2.5 mg/kg腹腔注射，SchB用生理鹽水溶解后按200 mg/kg灌胃。腹腔注射劑量為0.2 ml，灌胃劑量為0.4 ml，連續(xù)處理7 d。單純順鉑組:早上腹腔注射順鉑，晚上生理鹽水灌胃;單純SchB組:早上生理鹽水腹腔注射，晚上SchB灌胃;SchB聯(lián)合順鉑組(以下簡稱聯(lián)合組):早上腹腔注射順鉑，晚上SchB灌胃。對照組:早上生理鹽水腹腔注射，晚上生理鹽水灌胃。

1.2.2 蘇木素-伊紅(HE)染色觀察凋亡細胞形態(tài) 接種后第9天處死小鼠，剖出完整的腫瘤組織，用4%的多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片，用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級乙醇至水洗，最后進行常規(guī)HE染色，在顯微成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

1.2.3 p53表達檢測 分離出實體瘤組織，肉眼下切取無壞死1 mm3腫瘤組織2塊，用10%甲醛固定后進行常規(guī)石蠟包埋。免疫組化用常規(guī)親和素-生物素-過氧化酶復合體(SABC)法，具體操作按說明書進行。統(tǒng)計學處理:分別觀察制片后的p53表達，細胞膜和細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或褐色為半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)表達陽性細胞，胞漿和胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或褐色為p53陽性表達細胞。顯微鏡下選取每個區(qū)域不重復隨機10個高倍視野(×400)，計算p53陽性細胞數(shù)，求均值。

1.3 統(tǒng)計學方法 應 用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)資料以表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 聯(lián)合用藥對小鼠H22實體瘤細胞形態(tài) 鏡下觀察，與對照組比較，用藥組出現(xiàn)腫瘤細胞減少，并大面積壞死;染色質(zhì)固縮濃染，有的呈半月形，緊貼于核膜周邊，部分細胞裂解為碎片狀。細胞形態(tài)學改變見圖1。

圖1 聯(lián)合用藥組(HE，×400)

2.2 聯(lián)合用藥對p53表達的影響 實驗結(jié)果表明，單純順鉑組與單純SchB組p53的陽性率與對照組比較差別有統(tǒng)計意義(P＜0.05)，且聯(lián)合組與對照組比較差別有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。方差分析顯示單純順鉑組與單純SchB組間p53差異無顯著性，聯(lián)合組抑瘤率明顯高于單純順鉑組及單純SchB組(P＜0.05)。見表1。

表1 各抗腫瘤藥物對H22小鼠實體瘤p53表達影響(%)

3 討論

凋亡細胞〔2〕的形態(tài)學改變可分為三個階段:①凋亡起始階段的細胞形態(tài)學變化主要是有完整細胞膜，但特化結(jié)構(gòu)消失，細胞間的接觸消失，仍然有選擇透性;染色質(zhì)出現(xiàn)固縮，沿著核膜分布，形成新月形帽狀結(jié)構(gòu)等形態(tài)。②第二階段形成凋亡小體。核染色質(zhì)發(fā)生斷裂，形成大小不等的片段，與某些細胞器如線粒體一起聚集，為反折的細胞膜所包圍。從外觀上看，細胞表面產(chǎn)生了許多泡狀或芽狀突起。以后，逐漸分離，形成單個的凋亡小體。③凋亡小體逐漸為臨近的細胞所吞噬并消化〔3〕。本實驗通過對腫瘤的HE染色，在顯微鏡下觀察顯示存在細胞凋亡，說明SchB五味子乙素可促進H22腫瘤細胞凋亡。

p53是一種抑癌基因，與多種基因之間構(gòu)成p53基因網(wǎng)絡，有促進細胞凋亡、阻滯細胞周期、維持基因組穩(wěn)定等功能〔4〕。當細胞內(nèi)DNA受損時，p53蛋白表達水平增高，導致細胞增殖終止，使受損的細胞獲得修復DNA的時間，假如無法修復，那么p53蛋白將持續(xù)增高，從而引起細胞凋亡。本實驗結(jié)果說明SchB聯(lián)合順鉑抑制腫瘤生長與p53高表達有關。

顧穎等〔5〕研究表明SchB可促進多柔比星誘導肝癌細胞(SMMC-7721)凋亡，梁軍等〔6〕研究 SchB對人胃癌細胞株(MGC-803)凋亡的影響。本實驗表明了SchB聯(lián)合順鉑可誘導腫瘤細胞凋亡，將進一步研究兩者聯(lián)合作用抑制腫瘤的機制，為SchB聯(lián)合順鉑在臨床應用提供更有力的依據(jù)。

1 劉力生，王 勤，鄭榮梁，等.五味子乙素對小鼠免疫功能、腹水型肝癌細胞DNA合成和存活率的作用〔J〕.蘭州大學學報(自然科學版)，1990;5(1):55-9.

2 呂冬霞.細胞生物學技術〔M〕.北京:科學出版社，2010:138.

3 翟中和，王喜忠，丁明孝.細胞生物學〔M〕.北京:高等教育出版社，2000:455-7.

4 Vogelstein B，Lane D，Levine AJ.Surfing the p53 network〔J〕.Nature，2000;408(6810):307-10.

5 顧 穎，李 凌.五味子乙素促進多柔比星誘導肝癌細胞SMMC7721凋亡的研究〔J〕.實用腫瘤雜志，2006;21(5):412-6.

6 梁 軍，宋曉玉，劉志新，等.五味子乙素對人胃癌細胞株MGC-803凋亡的影響〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(1):88-90.