鼠骨髓間充質干細胞誘導的成骨細胞與3－羥基丁酸/3－羥基己酸共聚物的體外相容性

馬敏先 周祥文 王 永 王 梅 (貴陽醫學院附屬醫院口腔修復科，貴州 貴陽 563003)

口腔種植技術與傳統的修復方法相比，由于具有更接近于天然牙的功能和美學修復效果，目前已成為修復牙列缺損或缺失的主要方法之一。然而，許多患者由于缺牙后的生理性吸收、外傷性缺損等因素造成牙槽骨骨量不足，而無法進行口腔種植修復。目前采用的骨組織引導再生術只能修復較小的骨缺損;自體骨移植雖然安全可靠，無免疫排斥，但存在供骨區并發癥的可能;異體骨移植能修復較大骨缺損，但存在免疫排斥。組織工程可以通過提取自體細胞體外培養骨組織來修復大段骨缺損，因此已成為口腔種植領域的主要研究方向〔1〕。組織工程的兩個重要因素分別是種子細胞和支架材料。骨髓間充質干細胞(BMSCs)由于具有高度自我更新能力及多向分化潛能，而成為最常用的種子細胞之一。支架材料目前以聚乳酸、聚羥基乙酸及其共聚物等為代表的高分子可吸收材料應用最為廣泛。3-羥基丁酸/3-羥基己酸共聚物(PHBHHx)因其出色的力學性能、良好的生物相容性和可完全降解性，而在組織工程和醫用材料領域備受關注〔2〕。本實驗通過SD大鼠BMSCs誘導的成骨細胞與PHBHHx支架材料體外復合培養，采用MTT法檢測其體外相容性，從而評估PHBHHx作為骨組織工程支架材料的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 1～2月齡SD大鼠(貴陽醫學院動物中心)。L-DMEM(美國Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季清公司)，地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸(美國Sigma公司)。倒置相差顯微鏡(Nikon)，掃描電鏡(貴陽醫學院電鏡室)。多孔仿生骨支架材料PHBHHx(清華大學化工系研制)。該材料為三維多孔立體結構，孔徑200～300 μm，孔隙率90%，且孔間相互連通(圖1)。將材料切割成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的正方體塊，高溫高壓消毒備用。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs分離培養及鑒定 采用全骨髓貼壁法分離BMSCs，接種至25 cm2培養瓶中，37℃，5%CO2培養箱內培養。2 d換液一次，待細胞融合至90% ～95%時，1∶2傳代。取第三代BMSCs細胞懸液，平均分成3組:CD29組、CD34組、CD90組，孵育、洗滌后待上流式細胞儀。

圖1 PHBHHx支架材料(SEM，×1 000)

1.2.2 誘導BMSCs向成骨細胞分化 收集第三代BMSCs分為兩組，對照組用完全培養基，實驗組用誘導培養基(完全培養基中加入地塞米松10～8 mol/L、β-甘油磷酸鈉10 mmol/L、維生素C 50 mg/L)。倒置相差顯微鏡下觀察兩者形態。

1.2.3 成骨細胞鑒定 將第三代BMSCs以1×104個/ml細胞密度接種于6孔培養板中(內含處理好的蓋玻片)，同時加入含誘導劑的完全培養基，維持培養14 d后進行堿性磷酸酶和茜素紅染色。堿性磷酸酶染色 固定液固定3 min，滴加底物應用液，加蓋疏水膜，放置濕盒中，避光，37℃孵育15 min，水洗，用復染液染3 min，水洗，拍片記錄。茜素紅染色 無水乙醇固定10 min，蒸餾水沖洗2次，放入0.1%茜素紅-Tris-HCl(pH8.3)染色，37℃染色30 min，蒸餾水沖洗，拍片記錄。

1.2.4 成骨細胞與PHBHHx復合培養 制備好的PHBHHx用含誘導劑的完全培養基浸泡，48 h后吸凈培養基，將第三代BMSCs以1×105個/孔的細胞密度接種于材料上，同時加入含誘導劑的完全培養基，并置于培養箱。24 h后，將細胞材料復合物轉移至24孔培養板中，并補加培養基至1 ml。2 d換液1次。

1.2.5 掃描電鏡觀察 取培養第9天的細胞/材料復合物用PBS清洗，戊二醛固定，梯度乙醇脫水，干燥，噴金，置于掃描電鏡下觀察。

1.2.6 MTT法檢測成骨細胞在PHBHHx上的增殖活性 實驗組將第三代BMSCs以1×105個/孔的細胞密度接種于PHBHHx，對照組將BMSCs以同樣密度直接接種于孔板底部，兩者同時加入200 μl含誘導劑的完全培養基。1、3、5、7、9 d 后，向兩組加入360 μl不含血清的培養基和40 μl MTT(5 g/L)，孵育4 h。棄上清，每孔加入150 μl DMSO，搖勻10 min，然后吸取100 μl加入96孔培養板中，選擇490 nm波長，酶標儀測定OD值。每組4個復孔，以上實驗重復3遍。

1.3 統計學分析 采 用SPSS11.5軟件分析，數據以表示，進行t檢驗。

2 結果

2.1 BMSCs形態學觀察 原代的BMSCs為少量短梭形、星形細胞分散貼壁生長，核呈橢圓形，傳代后的細胞為長梭形，分布均勻，排列規則呈流水狀(圖2)。

2.2 BMSCs的表型鑒定 流式細胞儀檢測結果顯示CD29、CD90、CD34陽性細胞比率分別為99.1%，88.8%，0.1%，說明所獲得的第三代BMSCs純度較高。

2.3 BMSCs誘導為成骨細胞的形態變化及鑒定 誘導組細胞為三角形、立方形、多邊形，體積增大，胞核內出現顆粒狀物質，增殖細胞間界限模糊，繼而復層生長。對照組細胞仍為長梭形(圖3)。堿性磷酸酶染色結果顯示，細胞核呈紫色，胞質中出現褐色或咖啡色顆粒。茜素紅鈣化結節染色細胞匯合后呈多層重疊生長，圓形的礦化結節呈紅色(圖4)。

2.4 成骨細胞在PHBHHx上的黏附情況 在300倍鏡下可見材料上的成骨細胞融合成片狀，邊緣有許多不規則的突起;而在1 000倍鏡下，成骨細胞伸出多個偽足固定于孔隙之間，部分細胞間以突起相互連接，沿孔道呈堆積樣生長，排列密集，分布均勻(圖5)。

2.5 MTT法檢測成骨細胞增殖情況 從接種后的第1天開始，細胞已較好地附著在培養板上。培養前3 d，細胞增殖緩慢，3 d后，細胞進入對數增長期，增殖加速，持續到第7天。7 d后，細胞進入平臺期，部分細胞開始凋亡，增殖放緩并略有下降。細胞接種后第3天開始，兩組相比差異顯著(P＜0.05)。見表1。

圖2 原代、第三代BMSCs在倒置相差顯微鏡圖像

圖3 誘導組與對照組細胞倒置相差顯微鏡圖像(×100)

圖4 成骨細胞染色結果

圖5 成骨細胞和PHBHHx支架材料復合培養后掃描電鏡

表1 PHBHHx對成骨細胞增殖的影響(OD，，n=12)

表1 PHBHHx對成骨細胞增殖的影響(OD，，n=12)

與對照組比較:1)P＜0.05

組別 第1天 第3天 第5天 第7天 第9天PHBHHx組 0.182±0.001 0.253±0.0031) 0.354±0.0051) 0.589±0.0011) 0.576±0.0011)0.002 0.505±0.001對照組 0.182±0.002 0.242±0.002 0.310±0.011 0.524±

3 討論

組織工程是通過一定的技術手段將種子細胞和支架材料有機結合起來，在支架材料逐步降解的同時，附著在材料上的細胞不斷增殖，最終形成骨組織。因此種子細胞、支架材料已成為組織工程的研究熱點。

BMSCs相對特異的表面抗原分別為 CD29、CD90、CD106等，非特異抗原為 CD34、CD45 等〔3，4〕。本實驗說明此細胞中造血干細胞含量極少，純度較高，同時對其進行成骨誘導，通過堿性磷酸酶和茜素紅染色呈陽性結果，可以說明所培養的細胞為BMSCs。

本實驗選用的PHBHHx是以HB(3-羥基丁酸酯)單體為主要成分，含有少量HHx(3-羥基己酸酯)單體的第三代PHAs(聚羥基脂肪酸酯)，是硬度和韌度都有良好的熱塑性材料〔5〕。同時，由于其最終分解為CO2和水，pH呈弱酸性，所以體內植入后炎癥反應發生率極低〔6〕，是近年來頗受關注的生物可降解材料。根據實驗結果發現成骨細胞在PHBHHx支架材料上能較好地黏附和增殖。考慮其原因可能為:微米級的孔徑可以為細胞的機械性刺激感受器提供合適的壓力和張力，有利于細胞增殖和黏附〔7，8〕;三維多孔支架材料的立體結構更有利于細胞吸收營養物質和排出代謝產物，同時也為細胞生長、增殖提供寬敞空間。7 d后成骨細胞增殖放緩并略有下降，其原因可能是:培養板中材料大小有限，不能為不斷增殖的細胞提供更多的生長空間，代謝廢物積聚較多，使部分細胞開始衰老、凋亡。PHBHHx是一種既疏水又不帶電荷的材料，實驗通過用含誘導劑的完全培養基浸泡支架材料的方法，提高材料的親水性，結果發現:材料上的成骨細胞表面光滑、增殖較快，說明經含誘導劑的完全培養基浸泡后的材料能模擬細胞的體外生長環境，有利于細胞的黏附和增殖。

我們將進一步對PHBHHx何時植入裸鼠體內及移植到負重部位后對其性狀和細胞的影響等方面進行研究。PHBHHx與成骨細胞有良好的體外相容性，是一種性能優良的骨組織工程支架材料，但其應用于骨組織工程的有效性，還有待于體內實驗的進一步探討。

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