大鼠原代前脂肪細胞及誘導分化方法的探討

陳 思 陳梅晞 龍冠晗 周 燕 (桂林醫學院附屬醫院呼吸內科，廣西 桂林 541000)

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(OSAHS)是一種睡眠呼吸障礙性疾病，發病率逐年升高，已成為危害人類健康的主要疾病之一。關于OSAHS的發病機制目尚未完全明確，但大量研究證實在OSAHS患者中存在嚴重脂肪代謝紊亂，其中由脂肪細胞分泌的細胞因子不僅調節糖脂代謝，還參與炎癥反應、免疫應答〔1〕。雖然對于體內脂肪細胞的來源一直存有爭議〔2〕，但前脂肪細胞作為一種基質細胞，具有分裂增生和向脂肪細胞分化的能力是毋庸置疑的〔3〕。為深入探索脂肪細胞分化調節機制對OSAHS的影響，有必要確立穩定的原代培養前脂肪細胞以及誘導分化為成熟脂肪細胞的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 桂林醫學院動物中心清潔級6 w雄性SD大鼠，體重約200 g左右。

1.1.2 主要實驗試劑和儀器 DMEM/F12(1∶1)細胞培養液(Hyclone公司 美國);高糖DMEM細胞培養液(Hyclone公司美國);胎牛血清(Hyclone公司美國);Ⅰ型膠原酶和胰蛋白酶(Gibco公司美國);3－異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、地塞米松、胰島素、油紅O、PI、RNA酶均購自美國Sigma公司。

1.1.3 主要試劑配置 基礎培養液:將10 ml胎牛血清加入90 ml DMEM/F12(1∶1)細胞培養液中，4℃保存。促分化液1:在高糖DMEM細胞培養液中，分別加入1 μmol/L地塞米松、10 mg/L胰島素、0.5 mmol/L IBMX，pH 值調至7.2，4℃保存。促分化液2:高糖DMEM細胞培養液中加入10 μg/ml胰島素，pH值調至7.2，4℃保存。消化液的配置:Ⅰ型膠原酶100 mg，溶于50 ml PBS中，過濾除菌，分裝后－20℃保存。1%油紅O原液:稱取0.4 g油紅O粉末，加入40 ml異丙醇，充分溶解后室溫保存備用。油紅O工作液:6 ml 1%的油紅O原液加入4 ml三蒸水，混勻后過濾，2 h內使用。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠前脂肪細胞的原代培養 改良von Heimburg等〔4〕方法，將大鼠斷頸處死，無菌條件下取出附睪及腎周圍脂肪墊，轉入超凈工作臺，冷磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3遍，去除肉眼可見的血塊和纖維組織。將脂肪墊轉移至裝有DMEM/F12(1∶1)細胞培養液的新培養皿中，眼科剪剪成1 mm3的小塊，加入等體積2 mg/mlⅠ型膠原酶，37℃水浴振蕩消化90 min，直至乳糜狀液體。將消化后的液體用200 μm孔徑的細胞篩過濾，1 200 r/min，8 min離心2次，所得沉淀細胞用5 ml基礎培養基重懸，接種于培養瓶內，放入37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養。

1.2.2 大鼠前脂肪細胞增殖活性的測定 取對數生長期的原代前脂肪細胞，常規消化收集細胞，預冷70%乙醇固定，－20℃保存。使用前1 600 r/min離心10 min棄去固定液，預冷PBS洗滌2次，400 μl RNA酶懸浮細胞。37℃水浴1 h后，用100 μl PI染液避光孵育30 min，FACSCalibar流式細胞儀進行細胞周期檢測，Misfit LT 2.0軟件進行結果分析。

1.2.3 大鼠前脂肪細胞的誘導分化 取3代內生長至80%融合的前脂肪細胞，促分化液1培養3 d，隔天換液。3 d后換促分化液2培養5 d，隔天換液。

1.2.4 油紅O染色 取誘導成功的脂肪細胞，用PBS洗3次，10%甲醛固定10 min;PBS洗3次，細胞晾干20 min，加油紅O工作液靜止10 min后，棄油紅O;加60%異丙醇洗分色，自來水沖洗，封片。

2 結果

2.1 大鼠前脂肪細胞形態學觀察 前脂肪細胞剛剛接種時呈類圓形，懸浮于培養基中，24 h可貼壁;3 d后細胞伸展，漸成梭形或多角梭形;6 d左右進入指數增長期，呈漩渦狀或魚群狀。見圖1。

2.2 大鼠前脂肪細胞增殖活性 流式細胞儀檢測細胞周期發現:G1+G0期細胞數占總數的79.7%，DNA含量平均值為75.77;G2期細胞數占總數的11.6%，DNA含量平均值為149.27;S期細胞數占總數的8.7%。

2.3 大鼠前脂肪細胞誘導分化及鑒定 對3代以內80%融合的前脂肪細胞換用促分化液1誘導培養3 d，細胞增殖停止，形態由梭形或多角梭形變為圓形，胞膜皺縮，胞漿內出現散在的反光顆粒，大小不等。3 d后換用促分化液2，細胞內的反光顆粒逐漸增多、增大，成葡萄串狀，將細胞核推向一側。培養7 d，反光顆粒融合充滿細胞。經油紅O染色，胞漿內的反光顆粒著橘紅色，可以鑒定前脂肪細胞已分化為成熟脂肪細胞。見圖2。

圖1 前脂肪細胞培養1 d、3 d(×200)

圖2 不同誘導時間脂肪細胞分化情況

3 討論

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(OSAS)作為一種代謝性疾病，與肥胖、糖尿病及各種心腦血管疾病關系密切，這些疾病之間存在了一個共同的病生理機制，即脂質代謝的紊亂。近年來脂肪細胞的增殖分化、代謝調節已成為研究熱點，國外多采用3T3-L1前脂肪細胞株作為研究模型，體外誘導分化〔5〕。但細胞珠傳代后會出現不同性狀改變及增殖分化率的下降。因此本研究選擇原代培養大鼠前脂肪細胞，取材方便，價格適中，性狀保持穩定，實驗處理因素比較少，從而獲得大量成分均一具有高增殖能力的前脂肪細胞。

3.1 前脂肪細胞的原代培養 關于大鼠前脂肪細胞的原代培養方法，雖然在很多文獻中均有提及，但本實驗確立了一種比較穩定的培養方法。在分離脂肪組織時，盡力避開纖維及血絲，保持組織成分單一;同時選擇在細胞培養液中剪碎，從而達到保護細胞提高成活率的作用。Ⅰ型膠原酶對組織進行消化的時間過短，細胞不能完全釋放，消化時間過長則會損傷細胞的活性;同時在37℃水浴晃動，不但能提高酶的活性，而且可增加組織與酶的接觸面積，減少酶作用時間過長對細胞的損傷〔6〕，最終確立90 min為最佳消化時間。

3.2 前脂肪細胞的增殖活性 本研究發現原代大鼠前脂肪細胞G1期，細胞DNA復制還沒有開始，也是DNA含量最少的，流式檢測結果圖的第1個峰;S期是一個1倍DNA到2倍DNA的過程，在流式結果圖中顯示期跨度特別大但不高;而G2期是DNA復制完成至分裂的一段時間，此時細胞內含2倍DNA，在流式結果圖中的第2個峰，從而提示大鼠原代的前脂肪細胞具有繼續分裂增殖的能力，細胞活性好。

3.3 前脂肪細胞誘導分化與鑒定 在誘導分化前脂肪細胞時本實驗使用了兩種無血清的促分化液。因為血清中含有大量生長因子，促進細胞增殖，若誘導時添加血清，即使胞漿內有脂滴生成但細胞形態仍為長梭形，不利于對細胞分化過程的把握。在促分化液1中，IBMX、胰島素和地塞米松共同發揮最大誘導效率，促進脂肪細胞由葡萄糖合成脂質的過程。3 d后長梭形前脂肪細胞分化為圓形，胞漿內開始充脂，此時已不需要大量脂肪細胞增殖基因的表達，因此換用僅含胰島素的促分化液2維持分化增加成脂率，最終成功誘導前脂肪細胞為脂肪細胞。原代培養的細胞成分較復雜，必須對所培養的細胞進行鑒定，油紅O染色可以簡便快速地測定體外培養前脂肪細胞的轉化率，因此本研究采用該方法鑒定前脂肪細胞向脂肪細胞的分化情況。

前脂肪細胞位于成熟的脂肪組織之中，能在體外擴增，具有定向分化為脂肪細胞的能力〔7，8〕。本研究成功建立了一種穩定高效的原代培養大鼠前脂肪細胞及誘導分化的方法，確立了優良的以脂肪細胞為載體的研究模型，為OSAS等相關代謝性疾病發病機制的研究奠定了基礎。

1 Rosen ED，Spiegelman BM.Adipocytes as regulators of energy balance and glucose homeostasis〔J〕.Nature，2006;444(7121):847-53.

2 Billon N，Monteiro MC，Dani C.Developmental origin of adipocytes:new insights into a pending question〔J〕.Biol Cell，2008;100(10):563-75.

3 Shahparaki A，Grunder L，Sorisky A.Comparison of human abdominal subcutaneous versus mental preadipocyte-differentiation in primary culture〔J〕.Metabolism，2002;51(9):1211-5.

4 von Heimburg D，Kuberka M，Rendchen R，et al.Preadipocyte-loaded collagen scaffolds with enlarged pore size for improved soft tissue engineering〔J〕.Int J Artif Organs，2003;26(12):1064-76.

5 Koh YJ，Kang S，Lee HJ，et al.Bone marrow-derived circulating progenitor cells fail to transdifferentiate into adipocytes in adult adipose tissues in mice〔J〕.J Clin Invest，2007;117(12):3684-95.

6 Fried SK，Moustaid-Moussa N.Culture of adipose tissue and isolated adipocytes〔J〕.Methods Mol Biol，2001;155:197-212.

7 Stacey DH，Hanson SE，Lahvis G，et al.In vitro adipogenic differentiation of preadipocytes varies with differentiation stimulus，culture dimensionality，and scaffold composition〔J〕.Tissue Eng Part A，2009;15(11):3389-99.

8 Stillaert FB，Di Bartolo C，Hunt JA，et al.Human clinical experience with adipose precursor cells seeded on hyaluronic acid-based spongy scaffolds〔J〕.Biomaterials，2008;29(29):3953-9.