髖關節骨性關節炎軟骨組織Ⅱ型膠原α1鏈和激活T細胞核因子1的表達水平及意義

蘆北極 王貴清 劉春磊 (暨南大學附屬清遠醫院骨科，廣東 清遠 511500)

髖關節骨性關節炎是一種高致殘疾病，主要特征是關節功能減退并伴有疼痛〔1〕。骨關節炎的主要病理表現為軟骨組織退變和磨損，軟骨損傷后很難修復〔2〕，因此加快軟骨組織修復對治療髖關節骨性關節炎意義重大。Ⅱ型膠原是關節軟骨基質膠原，由3條相同的Ⅱ型膠原α1鏈(Col2α1)組成，是軟骨組織修復的基礎〔3〕。關節炎是一種炎癥因子介導的免疫反應〔4〕。激活T細胞核因子1(NFAT1)是一種與炎癥相關的基因，可在T細胞及其他免疫細胞中表達〔5〕，因此推測其水平與關節炎的發生發展有關。目前，對髖關節骨性關節炎軟骨組織中Col2α1和NFAT1的研究較少。因此本研究分析髖關節骨性關節炎的Col2α1和NFAT1表達水平及臨床意義，為防治髖關節骨性關節炎提供依據。

1 材料與方法

1.1 一般資料 本院2011年6月至2012年6月骨科收治的36例髖關節骨性關節炎患者為關節炎組，其中男性21例，女性15例;年齡43～77歲，平均(65.1±7.5)歲，＞60歲者11例;左側17例，右側19例;原發性4例，繼發性32例;病程為(2.3±0.9)年，＞2年者 14例;關節炎嚴重性指數評分(ISOA)≤4者16例，＞4者20例;K-L放射線分級:Ⅰ+Ⅱ級者14例;Ⅲ+Ⅳ級者22例;輕度10例，中度15例，中度11例。并選取同期的40例股骨頸骨折患者為骨折組，其中男性23例，女性17例;年齡41～75歲，平均(64.8±10.2)歲，＞60歲者16例;左側25例，右側15例;骨折部位:頭下型31例，頸中型7例，合并股骨頭骨折2例。排除類風濕關節炎、腫瘤骨轉移及股骨頭壞死者。

1.2 組織標本收集 軟骨組織標本用于mRNA抽提和蛋白提取兩部分，均在本院的倫理委員會監督下進行組織標本收集，具體步驟:取全髖關節置換后的手術廢棄物，用刀片輕輕刮除髖關節表層軟骨，取髖關節股骨頭負重區域的深層軟骨。

1.3 試劑 RNAlater保存液，美國 Sigma公司;Rneasy Fibrous Tissue Mini kit，德國Qiagen公司;逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒，大連寶生物工程有限公司;Col2α1、NFAT1鼠抗人單克隆抗體，美國Santa Cruz公司;GADPH、辣根過氧化物酶(HRP)標記鼠二抗、兔二抗單克隆抗體，武漢博士德生物技術公司;其他試劑均為分析純。Col2A1和NFAT1引物均由Invitrogen公司合成。

1.4 RT-PCR法檢測mRNA水平 稱取軟骨標本1.2 g，提取總RNA，采用分光光度計檢測RNA濃度與純度。配制 RT反應液(反應在冰上進行)，在如下條件進行反轉錄37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ 4 h，將cDNA貯存于－20℃冰箱中備用。對cDNA模板進行優化，配置PCR反應液，兩步法PCR擴增目的基因。預變性:95℃ 30 s;PCR反應:95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環。結束后確認擴增和溶解曲線，以GAPDH為內參，采用ΔΔCt法分析實時定量擴增的效果。Col2α1上游:5'-GGTGTCAGGGCCAGGATGT-3';下游:5'-ACAATATCCTTGATGTCTCCAGGTT-3'。NFAT1上游:5'-AGCAGGGCGAGAGGAGAAAC-3';下游:5'-AGTCACTGGGATGCTGCAGAT-3'。GAPDH上游:5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3';下游:5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'。

1.5 Western印跡法檢蛋白水平 以1∶10(重量/體積)加蛋白裂解液，冰上勻漿處理，靜置1 h，高速離心(12 000 r/min×5 min)，取適量上清液與等體積2×上樣緩沖液混合后，65℃孵育10 min后，經過SDS-PAGE電泳后，轉至 PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后，以一抗為1∶500的抗 Col2α1，NFAT1一抗抗體進行雜交，室溫，1 h，以TBST充分洗膜3×5 min后，加入二抗(1∶5 000)進行雜交，室溫1 h，以 TBST充分洗膜3×5 min后，采用 ECL法曝光，內參為 GAPDH，并運用 Quantity-One軟件進行光密度分析。最終結果表示為與GAPDH條帶光密度的比值。

2 結果

2.1 兩組 Col2α1和 NFAT1的表達水平比較 關節炎組Col2α1和 NFAT1的 mRNA和蛋白水平均高于骨折組，除NFAT1的mRNA水平(P＜0.05)，其余均為P＜0.01，見表1和圖 1、圖 2。

表1 兩組Col2α1和NFAT1的表達水平()

表1 兩組Col2α1和NFAT1的表達水平()

與骨折組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 n mRNA水平(2－△△Ct)Col2α1 NFAT1蛋白水平Col2α1 NFAT1骨折組40 1.06±0.23 1.57±0.15 0.32±0.05 0.28±0.09關節炎組 36 1.65±0.412) 2.46±0.341) 0.67±0.112) 0.53±0.142)

圖1 兩組關節軟骨中NFAT1和Col2α1表達水平

圖2 兩組關節軟骨中NFAT1和Col2α1蛋白水平的Western原始記錄圖

2.2 髖關節骨性關節炎不同病理參數的mRNA水平情況Col2α1和NFAT1的mRNA水平在年齡、類型、病程、ISOA、K-L放射線分級及嚴重程度上有差異，除Col2α1的K-L放射線分級(P＜0.05)，其余均為P＜0.01;兩指標mRNA水平在性別和側別上無統計學差異。見表2。

2.3 髖關節骨性關節炎不同病理參數的蛋白水平情況Col2α1和NFAT1的蛋白水平在年齡、類型、病程、ISOA、K-L放射線分級及嚴重程度上有差異，除Col2α1的類型(P＜0.05)，其余均為P＜0.01;兩指標mRNA水平在性別和側別上無統計學差異。見表2。

表2 髖關節骨性關節炎患者不同病理參數Col2α1和NFAT1的mRNA和蛋白水平()

表2 髖關節骨性關節炎患者不同病理參數Col2α1和NFAT1的mRNA和蛋白水平()

與對應項比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

年齡(歲)≤60 1.27±0.32 1.86±0.24 0.34±0.12 0.31±0.09＞60 1.82±0.572)2.74±0.612)0.86±0.372)0.78±0.252)側別左側 1.57±0.43 2.36±0.31 0.59±0.14 0.47±0.11右側 1.68±0.46 2.52±0.39 0.72±0.17 0.58±0.15類型原發性 1.14±0.25 1.93±0.33 0.46±0.26 0.28±0.07繼發性 1.91±0.612)2.66±0.542)0.83±0.141)0.82±0.222)病程(年)≤2 1.33±0.35 2.07±0.42 0.44±0.15 0.31±0.12＞2 1.87±0.732)2.73±0.632)0.91±0.322)0.77±0.242)性別男 1.58±0.46 2.53±0.47 0.61±0.15 0.58±0.15女 1.69±0.52 2.38±0.35 0.74±0.09 0.51±0.17 ISOA≤4 1.36±0.36 2.13±0.36 0.35±0.12 0.33±0.10＞4 1.88±0.752)2.80±0.722)0.78±0.252)0.81±0.282)K-L放射線分級Ⅰ+Ⅱ 1.45±0.26 1.93±0.26 0.27±0.08 0.36±0.12Ⅲ+Ⅳ 1.73±0.431)2.85±0.882)0.93±0.262)0.85±0.252)嚴重程度輕度 1.15±0.28 2.24±0.34 0.34±0.12 0.29±0.14中度+重度 1.82±0.682)2.86±0.552)0.85±0.252)0.83±0.232)

3 討論

Col2α1與關節軟骨形成及關節內成骨密切相關。異常機械應力和滑膜炎癥可影響軟骨基質的代謝平衡，導致關節軟骨表面的Ⅱ型膠原水平降低，同時機體會代償性的增加深面Ⅱ型膠原水平〔6〕。本研究提示關節炎患者軟骨組織中的Col2α1水平上調，可能原因是關節炎患者的炎癥反應導致軟骨組織代償性地增加Col2α1水平，來促進軟骨組織的修復。這與Pickarski等〔7〕在前交叉韌帶切斷和半月板切除誘導的骨性關節炎模型中的發現一致，同時還發現損傷部位關節軟骨和軟骨下骨中的血管浸潤標記物VEGF和CD31水平的上調。此外，也有相關報道指出Col2α1可改變軟骨細胞表型，進而導致軟骨礦物質成分改變和鈣化增厚，使關節炎癥狀惡化〔8〕。張雪蓮等〔9〕認為Col2α1的異常表達引起Ⅱ型膠原結構異常，可導致骨骼-軟骨發育異常疾病。

此外，本研究提示軟骨組織中的NFAT1水平上調，表明關節炎患者軟骨組織中的炎癥反應被激活，是導致關節軟骨損傷的直接原因。本研究的特色之一是分析不同病理參數的兩指標水平，發現均與病理參數相關，如在年齡、類型、病程、ISOA、K-L放射線分級及嚴重程度上有差異，且病情嚴重者的水平較高，提示可用于疾病的診斷和預后預測，如崔英霞等〔10〕將Col2α1基因突變情況用于先天性脊柱骨骺發育不良的產前診斷，具有一定的臨床價值。

1 趙鐵軍，張洪美，陳衛衡，等.髖關節骨性關節炎的分級治療探討〔J〕.中國骨傷，2010;23(9):665-7.

2 張榮凱，方 航，盧華定，等.MMP3在早期骨關節炎模型軟骨下骨的表達及其意義〔J〕.中國病理生理雜志，2011;27(12):2391-5.

3 錢曉偉，潘丹岷，譚湘陵，等.中藥血清對大鼠bMSCs體外成軟骨分化中Col2α1和Acan表達的影響〔J〕.時珍國醫國藥，2012;23(2):340-3.

4 盛璞義，張陽春，侯昌禾，等.14例炎癥性關節炎患者行全膝關節置換翻修術的臨床效果及分析〔J〕.中華關節外科雜志(電子版)，2011;5(1):20-6.

5 Rollín R，Marco R，Jover JA，et al.Early lymphocyte activation in the synovial microenvironment in patients with osteoarthritis:comparison with rheumatoid arthritis patients and healthy controls〔J〕.Rheumatol Int，2008;28:757-64.

6 Fan B，Onteru SK，Mote BE，et al.Large-scale association study for structural soundness and leg locomotion traits in the pig〔J〕.Genet Sel Evol，2009;41:14.

7 Pickarski M，Hayami T，Zhuo Y，et al.Molecular changes in articular cartilage and subchondral bone in the rat anterior cruciate ligament transection and meniscectomized models of osteoarthritis〔J〕.BMC Musculoskelet Disord，2011;12:197.

8 崔英霞，夏欣一，楊 濱，等.COL2A1基因突變致先天性脊柱骨骺發育不良的軟骨組織超微結構觀察〔J〕.醫學研究生學報，2009;22(4):376-9.

9 張雪蓮，曲建平，任立紅，等.COL2A1基因突變致骨骼-軟骨發育疾病研究進展〔J〕.國際遺傳學雜志，2012;35(2):119-24.

10 崔英霞，夏欣一，馮 耀，等.COL2A1基因突變所致先天性脊柱骨骺發育不良的產前分子診斷〔J〕.臨床檢驗雜志，2007;25(4):254-6.