高效液相色譜法測(cè)定田七痛經(jīng)膠囊中原兒茶酸含量

趙嚴(yán)麗，曾奇風(fēng)

(1.廣東省河源市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 河源 517000;2.廣東醫(yī)學(xué)院，廣東 東莞 523000)

田七痛經(jīng)膠囊由五靈脂、三七、蒲黃、延胡索、木香等8味中藥組方，具有通調(diào)氣血、止痛調(diào)經(jīng)的功效，用于經(jīng)期腹痛及因寒所致的月經(jīng)失調(diào)。方中五靈脂具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)的作用，原兒茶酸是其主要有效成分，可補(bǔ)血、活血、通絡(luò)，用于月經(jīng)不調(diào)。本試驗(yàn)中以田七痛經(jīng)膠囊主要有效成分原兒茶酸為指標(biāo)，采用高效液相法測(cè)定其含量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

島津LC－2010 A型高效液相色譜儀;島津UV－1601型紫外分光光度計(jì);MettlerAG－135型電子分析天平(準(zhǔn)確度0.01 mg);KQ250DA型超聲清洗器。原兒茶酸對(duì)照品(供含量測(cè)定用，批號(hào)為110809－200604，中國(guó)藥品生物制品檢定所);田七痛經(jīng)膠囊(亞寶藥業(yè)大同制藥有限公司，批號(hào)分別為20100901，20101006，20110609，規(guī)格為 0.4 g/粒);乙腈為色譜純，甲醇、磷酸、乙酸乙酯均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Inertsil C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈－0.2%磷酸(8∶92);測(cè)定波長(zhǎng):260 nm;柱溫:40℃;流速:0.6 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL。理論板數(shù)按原兒茶酸峰計(jì)應(yīng)不低于5000。

2.2 溶液制備

精密稱取原兒茶酸對(duì)照品適量，加50%甲醇制成質(zhì)量濃度為0.1075 g/L的對(duì)照品貯備液;再精密量取對(duì)照品貯備液適量，加50%甲醇制成8.6 μg/mL的對(duì)照品溶液。取裝量差異項(xiàng)下的樣品內(nèi)容物約2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入0.1 mol/L鹽酸2 mL潤(rùn)濕，再精密加入乙酸乙酯50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲1 h使溶解，放冷，再稱定質(zhì)量，用乙酸乙酯補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取處方中除五靈脂外的其余藥材，按處方量依法制成粉末，再按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn):分別精密吸取2.2項(xiàng)下3種溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。由圖1可見，供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上有相同保留時(shí)間的色譜峰，陰性對(duì)照品溶液無(wú)干擾，表明方法可行。

線性關(guān)系考察:分別精密吸取質(zhì)量濃度為8.6 μg/mL的對(duì)照品溶液 5，10，15，20，25，30 μL，注入液相色譜儀，測(cè)量峰面積。以峰面積(A)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得原兒茶酸回歸方程 A=6371142.8571C－731.3333，r=1.0000(n=6)。結(jié)果表明，原兒茶酸進(jìn)樣量在0.043～0.258 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):精密吸取原兒茶酸對(duì)照品溶液(8.6 μg/mL)20 μL，重復(fù)進(jìn)樣 5次。結(jié)果峰面積的 RSD 為 0.2%(n=5)，表明儀器精密度較好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品(批號(hào)為20100901)溶液，室溫下放置，于 0，4，8，12，24 h 時(shí)分別進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果的 RSD 為 0.8%(n=5)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):取樣品(批號(hào)為20100901)5份，依法制備供試品溶液并測(cè)定。結(jié)果原兒茶酸含量的 RSD為0.5%(n=5)，表明方法重復(fù)性較好。

加樣回收試驗(yàn):精密稱取已知含量的樣品(批號(hào)為20100901，原兒茶酸含量為 62.5555 μg/g，平均粒重 0.4082 g)適量，共 6 份。另取原兒茶酸對(duì)照品14.41 mg，用50%甲醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為 14.41 μg/mL 的溶液，精密量取 4，5，6 mL 各 2 份，加入到6份樣品中，按供試品溶液制備方法制備溶液，依法測(cè)定。結(jié)果見表1。

表1 原兒茶酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測(cè)定

分別精密吸取供試品溶液與對(duì)照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定3批樣品的原兒茶酸峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果批號(hào)為20100901，20101006，20110609的3批樣品，平均粒重分別為 0.4082，0.4054，0.4038 g，每粒含原兒茶酸分別為25.54，24.84，24.96 μg。

3 討論

用紫外分光光度計(jì)對(duì)對(duì)照品溶液在200～400 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描，結(jié)果在260 nm波長(zhǎng)處具有最大吸收。故選擇260 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

試驗(yàn)中采用了兩種不同的溶劑提取原兒茶酸，即乙酸乙酯和甲醇，結(jié)果表明，乙酸乙酯提取法較甲醇提取法所提的產(chǎn)物的色譜峰分離清晰、峰面積高，故選擇乙酸乙酯提取法。試驗(yàn)中比較了兩種不同比例的流動(dòng)相，即乙腈－0.2%磷酸溶液(4∶96)和乙腈 －0.2%磷酸溶液(8∶92)，結(jié)果表明，用乙腈 －0.2%磷酸溶液(8∶92)作為流動(dòng)相時(shí)，色譜圖基線較穩(wěn)，樣品中原兒茶酸與其他雜質(zhì)峰能夠完全分離，原兒茶酸的理論板數(shù)大于5000。

本方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性及回收率均理想，可以作為該制劑的質(zhì)量控制方法。

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