十二烷烴降解菌的篩選，鑒定及降解條件的優化

楊姣英，張玉霞，蔣林時

（遼寧石油化工大學 環境與生物工程學院， 遼寧 撫順 113001）

隨著石油工業的發展，石油在開采，運輸，裝卸，加工和使用的過程中，由于泄露和排放，引起土壤的污染，造成土壤的鹽堿化，毒化和廢棄，甚至有毒物質通過農作物尤其地下水進入食物鏈，最終直接危害人類[1]。用物理方法治理土壤的石油污染的同時會破壞土壤的結構和組分，而且價格昂貴不易實施。使用化學的方法又會造成二次污染[2]。因此，利用生物修復技術治理石油污染的土壤的方法日益受到人們的重視[3]。石油烴中，烷烴占 90%左右，直鏈烷烴大約占15%～30%，是主要的污染物。不同的石油降解菌對不同的烴類分子的降解特性不同。本研究以正十二烷烴為唯一碳源，從遼河油田采油井附近被油污染的土壤中分離和篩選出一株可以高效降解烴類的微生物，并通過對其形態和生理生化特性的研究，初步做出鑒定，并通過改變培養條件，提高其降解性能。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株來源

采自遼河油田采油井附近長期被油污染的土壤中。

1.1.2 培養基配置

無機鹽培養基：NaH2PO40.2 g，(NH4)2SO40.1 g，無水 CaCl20.02 g，NaNO30.1 g，MgSO47H2O 0.04 g，K2HPO40.2 g，用蒸餾水定容至0.2 L，用NaOH調節pH至7.0。

富集培養基：蛋白胨2.0 g，牛肉膏1.0 g，氯化鈉1.0 g，用蒸餾水定容至0.2 L，用NaOH調節pH至7.0。

固體培養基：各培養基中加入 1.8%(質量分數)的瓊脂。pH為7.0，高溫濕熱滅菌，倒平板或制成試管斜面。

十二烷培養基：無機鹽培養基 120 ℃滅菌 20 min后加入正十二烷作為唯一碳源。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的篩選分離及鑒定

取由40目篩篩過的土壤2.0g，放入裝有100 mL富集培養基的250 mL錐形瓶中，并加入0.07 mL正十二烷(錐形瓶內正十二烷濃度為 500 mg/L)，放在溫度為35 ℃，轉速為200 r/min的搖床里培養，每2 d接種一次，接種量為10%[4]，正十二烷濃度逐漸增加至1.0、1.5和2.0 g/L。當十二烷的濃度增加到2.0 g/L后，以10%的接種量接種到十二烷培養基中，十二烷的濃度為2.0 g/L。馴化培養4 d。配置正十二烷的濃度為0.5 g/L的，采用平板稀釋法將馴化了4 d后的菌液涂布已配置好的無機鹽固體平板培養基中，放到 35 ℃的恒溫培養箱中培養一個星期后，挑選出菌型比較良好的單菌落在含正十二烷濃度為0.5 g/L的富集平板培養基上反復劃線純化直到純菌種培養，保存菌種備用。

1.2.2 測定菌株的降解率

取純化后保存的菌種活化，按接種量為10%取活化后的菌液加入正十二烷的濃度為0.5 mg/L的無機鹽培養基中，為提高實驗準確性，另取不接種的無機鹽培養基作為空白對照。設定搖床的培養條件為溫度35 ℃，轉速200 r/min，連續培養2 d。然后離心菌液（轉速3 500 r/min，離心20 min)，將上清液倒入錐形瓶中，先加入50%濃硫酸酸化，取適量的石油醚萃取2～3次，收集上層清液用無水硫酸鈉脫水、過濾、定容，采用紫外分光光度計測定內正十二烷殘留量，并計算正十二烷的降解率[5]。

1.2.3 測定菌株的生長量

取菌種活化，在不同的時間段用移液管移取錐形瓶中適量的菌液，在波長600 nm處用紫外可見分光光度計測定其吸光度值(OD600)，用去離子水做空白實驗，以濁度表示菌體的生長量。

1.2.4 降解菌株的鑒定

通過觀察菌體形態，菌落特征及生理生化特性實驗，根據《常見細菌系統鑒定手冊》[6]及《伯杰細菌鑒定手冊》[7]鑒定菌種。

2 結果與討論

2.1 降解菌株的篩選分離及鑒定

經過多次富集培養和篩選、分離與純化，得到一株具有降解十二烷能力的菌株，命名為SHY1。

SHY1菌菌落較大，表面光滑，金黃色，邊緣整齊的不規則短桿狀，有鞭毛。革蘭氏染色為陰性，具有硝酸鹽的反硝化作用，可以利用明膠，氧化酶陽性，氧化葡萄糖產酸不產氣，不能利用淀粉，M.R反應為陽性，吲哚反應為陰性V.P反應為陰性，接觸酶實驗為陽性。由以上生理生化特性推斷，SHY1菌為假單胞菌屬（Pseudomonas）。

2.2 培養時間對菌株的影響

將菌株按10%接種量接種于含500 mg/L正十二烷的90 mL富集培養基中，35 ℃、200 r/min搖床培養，定時取樣。結果如圖1所示。

圖1 培養時間對菌株生長的影響Fig.1 Effect of cultivating time on the strain growth

在接種0～10 h，因菌種代謝系統需要適應新的環境，生長量(以OD600表示，下同)較低，為延滯期；在10～28 h時，該曲線上升趨勢增大，菌種處于對數生長期；28～46 h，生長曲線趨于平緩，因為隨著微生物大代謝繁殖，菌液中的營養物比例失調，代謝產生的有害物質大量積累，新繁殖的細胞數與衰亡的細胞數相等，進入穩定生長期；46 h后，生長曲線開始下降，單位時間內菌液中的細胞死亡數多于新生的細胞數，菌體進入衰敗期。從該生長曲線上看，該菌適應和調整的時間比較短暫，這表明該菌的繁殖速度較快，有較強的繁殖能力，同時對數生長期較長，對實際應用較有利。

2.3 環境條件對正十二烷烴降解及菌株生長影響

2.3.1 接種量的影響

控制接種量分別為5%，10%，15%，18%，20%。在35 ℃條件下搖床培養72 h，測定菌株生長量和正十二烷降解率。根據實驗所得的數據得到圖2。

圖2 接種量對菌株生長和正十二烷降解的影響Fig.2 Effect of inoculation on the growth of strain and degradation of dodecane

圖2表明，接種量為5%～10%時，正十二烷的降解率和菌株生物量隨接種量的增大而升高；當接種量為10%時，降解率達到最大值；接種量為10%～18%時菌體的生長量繼續上升，但是正十二烷的降解率反而開始降低；接種量為18%～20%時菌體生長量開始降低，正十二烷的降解率繼續降低。接種量的大小會影響延滯期的長短，接種量過小時，會使延滯期較長，菌體生長慢，從而影響正十二烷的降解率。但是，接種量過大則會使內部營養物的消耗加速，同時代謝產物積累過多，溶氧不足，毒性隨之增強[8]。因此，從經濟角度考慮，實際操作時采用接種量為10%時為最佳。

2.3.2正十二烷濃度的影響

分別以濃度為 100，200，500，1 000，1 500和2 000 mg/L的正十二烷，按10%接種量接種，在35 ℃條件下搖床培養72 h，測定菌株生長量和正十二烷降解率，根據實驗所得的數據得到圖3。

圖3 正十二烷濃度對菌株生長和正十二烷降解的影響Fig.3 Effect of dodecane mass concentration on the growth of strain and degradation of dodecane

由圖3可見，正十二烷濃度為500 mg/L時，正十二烷降解率和菌株生長量均較高，高于500 mg/L時，正十二烷降解率和菌體生長量都會隨著濃度的增加而降低。因為隨著正十二烷的濃度的增加，細菌數量大幅度增加，促進了對正十二烷的生物降解；但當正十二烷的濃度過大時，有可能阻礙了氧的傳遞，導致菌體不能良好生長，從而使降解率下降。因此，適合接種SHY1菌的正十二烷的濃度為500 mg/L。

2.3.3 pH值的影響

控制這pH分別為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，向各瓶中加入濃度為500 mg/L(0.07 mL)的正十二烷，按10%接種量接種，在35 ℃條件下搖床培養72 h，測定菌株生長量和正十二烷降解率。根據實驗所得的數據得到圖4。

圖2-4表明：正十二烷的降解率在pH為4.0～8.0時，隨著pH的不斷增加而逐漸增大，在pH為8.0時降解率達到最大值，此后隨著pH的增加又逐漸減小。所以該菌株在pH為8.0的弱堿性條件下對正十二的降解率比較高。過高或過低的初始pH對菌株的生長和正十二烷的降解都不利于。

圖4 初始pH對菌株生長和正十二烷降解的影響Fig.4 Effect of initial pH on the growth of strain and degradation of dodecane

2.3.4 溫度的影響

濃度為500 mg/L(0.07ml)的正十二烷，按10%的接種量接種，分別在25, 30, 35, 37, 40 ℃條件下搖床培養72 h以后，測定菌株生長量和正十二烷降解率。根據實驗所得的數據得到圖5。

圖5 溫度對菌株生長和對正十二烷降解的影響Fig.5 Effect of temperature on the growth of strain and degradation of dodecane

圖2 -5表明：該菌種在溫度為30～37 ℃時，菌體生長速度有所增加，且在 37 ℃時菌體生長量達到最高；溫度低于30 ℃或高于37 ℃時，菌株的生長受到抑制，因此菌株的最適生長溫度為37 ℃。

3 結 論

(1) 通過對遼河油田采油井附近長期被油污染的土壤進行馴化、篩選和分離，得到一株能夠以正十二烷為唯一碳源進行生物降解的正十二烷降解菌(SHY1菌)。經鑒定為假單胞菌屬(Pseudomonas)。

(2) 通過生長條件優化得出，SHY1菌株的最適生長條件是：培養基的初始pH=8.0，溫度為37 ℃，接種量為10%。

(3) 在最適的條件下，當培養基中正十二烷的含量為500 mg/L時，在72 h內降解率可達65.2%。

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［2］鄧紹云，徐學義，邱清華．我國石油污染土壤修復研究現狀與展望[J].北方園藝，2012 (14)：184-190．

［3］李景全，肖盟，石布乾．生物強化技術在油田污水處理工程中的應用[J].油田化學，2011，28（3）：338-341．

［4］向麗君，陳雙扣，余媛媛. 石油烴降解菌的篩選及其生長條件研究[J].工業安全與環保，2012，38（7）：65-67．

［5］王國惠．環境工程微生物學實驗[M].北京：化學工業出版社，2011：111-113．

［6］東秀珠，蔡妙英．常見細菌系統鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001：128-132．

［7］布坎南，吉本斯．伯杰細菌鑒定手冊[M].北京：科學出版社，1998：274-280．

［8］Michail M Yakimov，Kenneth N Timmis，Peter N Golyshin. Obligate oil-degrading marine bacteria [J].Current Opinion in Biotechnology，2007，18（3）：257-266．