環孢菌素A生產菌原生質體轉化系統的建立

戴 夢,劉 靜,趙 穎,張 佳,章 麗,鄭桂珍

(華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司微生物藥物國家工程研究中心,河北石家莊050015)

環孢菌素A生產菌原生質體轉化系統的建立

戴 夢,劉 靜,趙 穎,張 佳,章 麗,鄭桂珍

(華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司微生物藥物國家工程研究中心,河北石家莊050015)

以腐草霉素抗性為選擇標記,建立了環孢菌素A生產菌株的基因轉化體系,成功將外源基因轉入環孢菌素A生產菌,并整合到染色體上。傳代實驗表明,外源基因可以穩定表達。該體系的建立為環孢菌素A生產菌的基因工程育種奠定了基礎。

環孢菌素A;多孔木霉;原生質體轉化

環孢菌素A是由11個氨基酸組成的環肽,20世紀70年代由瑞士巴塞爾(Basel)的Sandoz公司實驗室發現,并由該公司成功上市[1]。1978年,環孢菌素A被應用于第一例腎移植患者。因其具有免疫抑制活性強、對骨髓的毒性低等特點,目前廣泛應用于異體器官移植后的排異反應及一些自體免疫缺陷疾病的治療。除免疫抑制活性外,環孢菌素A還具有抗真菌、抗寄生物及抗炎活性[2]。2005年,環孢菌素A的年銷售額已達10億美元[3]。工業生產中,環孢菌素A由絲狀真菌多孔木霉(Tolypocladium inflatum,又名雪白白僵菌Beauveria nivea)深層發酵產生。催化環孢菌素A生物合成的環孢菌素A合成酶,為多功能非核糖體多肽合成酶,分子量約1.6 MDa,由11個模塊組成[4],定位于液泡膜上[5]。通過傳統的誘變篩選及培養條件的優化,環孢菌素A的產量不斷提高[6-8]。但對于產量已較高的生產菌株,再通過常規的誘變育種來提高產量就很困難。基因工程和代謝途徑工程技術的發展,為工業生產菌種的改良和改造提供了更為直接有效的手段,在很多品種上已經獲得了成功[9-11]。但對于環孢菌素A生產菌,特別是高產菌株的基因工程改造還鮮見報道。作者針對環孢菌素A生產菌原生質體制備、再生、轉化條件進行探索,建立了可行的轉化體系,為后續的環孢菌素A生產菌株的基因工程育種奠定了基礎。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 菌種、質粒與試劑

環孢菌素A高產菌株多孔木霉(Tolypocladium inflatum)060901,華北制藥集團新藥研究有限責任公司。質粒pPIPKA,自行保存,含有融合了產黃青霉異青霉素N合成酶基因啟動子(Pipns)的腐草霉素抗性基因[12]。

裂解酶、麥芽粉,Sigma公司;酵母粉、蛋白胨, Oxoid公司;Easy-DNA試劑盒,Invitrogen公司;腐草霉素,InvivoGen公司;其它試劑均為國產。

1.1.2 培養基、緩沖溶液

菌絲培養基和高滲培養基均參照Weber等[13]方法配制,略作改進。菌絲培養基:一水麥芽糖5%,蛋白胨1%,KH2PO40.5%,KCl 0.25%,p H值5.6。高滲培養基:麥芽粉2%,酵母粉0.4%,山梨醇21. 8%,瓊脂0.8%,p H值5.7。

斜面培養基:可溶性淀粉1.5%,玉米漿1.0%,蛋白胨0.15%,蔗糖0.25%,KH2PO40.025%,瓊脂2.5%,p H值5.0。

原生質體制備及轉化緩沖溶液[12]:KMP(KCl 0.7 mol·L-1,甘露醇0.8 mol·L-1,磷酸鉀緩沖溶液20 mmol·L-1,p H值6.3),KMPC(KMP加50 mmol·L-1CaCl2),PPC(PEG3500 40%,CaCl250 mmol·L-1,磷酸鉀緩沖溶液20 mmol·L-1,p H值6.3)。

1.2 方法

1.2.1 多孔木霉060901對腐草霉素的敏感性考察

制備多孔木霉060901孢子液,取適量涂布在含不同濃度腐草霉素的高滲培養基和斜面培養基平板上, 28℃下培養10 d左右,觀察其生長情況。

1.2.2 原生質體制備

接種多孔木霉060901到菌絲培養基,孢子終濃度為6.5×106個·m L-1,28℃、230 r·min-1下培養72 h。收集菌絲,用含0.5%裂解酶的KMP溶液28℃下處理1 h,過濾除去菌絲碎片,900 g、4℃下離心10 min收集原生質體,用0.8 mol·L-1KCl溶液洗原生質體2次,原生質體懸于KMPC溶液,終濃度為1.5 ×108個·m L-1。

1.2.3 原生質體轉化

取200μL原生質體加到2 m L離心管中,加50μL PPC溶液和5μg質粒p PIPKA,冰上放置30 min,再加1 m L PPC溶液,混勻加到高滲培養基中,倒平板。28℃下培養20 h左右,加蓋腐草霉素抗性(5 μg·m L-1),28℃下繼續培養10 d左右,挑取腐草霉素抗性克隆,轉接到含2μg·m L-1腐草霉素的抗性斜面培養基上,培養7 d左右。

1.2.4 轉化子分析

1.2.4.1 基因組DNA提取

取斜面孢子接種到菌絲培養基,28℃下振蕩培養48 h,取菌絲,液氮研磨,用Easy-DNA試劑盒提取DNA基因組。

1.2.4.2 轉化子基因水平鑒定

采用文獻[13]設計的腐草霉素抗性基因的引物ph1、ph2,以出發菌株及陽性克隆的基因組DNA為模板進行PCR擴增,通過瓊脂糖凝膠電泳對轉化子進行鑒定。

2 結果與討論

2.1 多孔木霉060901對腐草霉素的敏感性

腐草霉素抗性為絲狀真菌基因轉化中常用的篩選標記。實驗表明,多孔木霉對腐草霉素極為敏感,在高滲培養基中加入1μg·m L-1的腐草霉素即可抑制其生長;在斜面培養基上加入2μg·m L-1的腐草霉素,只有少數菌落能生長,且形態與對照菌株有明顯的區別。因此,嘗試采用含有腐草霉素抗性基因的產黃青霉轉化載體pPIPKA建立多孔木霉的轉基因體系。

2.2 多孔木霉060901原生質體轉化

原生質體的制備方法參考了產黃青霉的制備和轉化方法[12],主要對菌絲的培養條件進行了優化,根據該菌生長慢、易結球的特點,采取了加大接種量、并在搖瓶中加玻璃珠的方法,菌絲培養48～96 h均可得到原生質體,但以72 h效果最好,原生質體的制備量大,達7×107個·g-1濕菌絲,且再生率高,在30%左右。原生質體量和質粒量對轉化效率的影響見表1。

表1 原生質體量和質粒量對轉化效率的影響Tab.1 The effect of protoplast amount and plasmid amount on transformation efficiency

由表1可以看出,毎個轉化反應選用3×107個· g-1濕菌絲的原生質體和5μg質粒的轉化效果比較好。經過多批轉化,發現批次間的差異比較大,可能一些細微的變化也會對轉化效率造成影響。

2.3 轉化子鑒定

經過轉化共得到能在腐草霉素抗性斜面上正常生長的菌株228株,隨機挑選部分菌株提取基因組DNA,并以其為模板,用腐草霉素抗性基因引物ph1/ ph2進行PCR擴增,結果表明所選菌株均有預期的腐草霉素抗性基因(圖1)。

2.4 傳代實驗

轉化菌株在無抗性斜面傳代5次,再接種到含腐草霉素的斜面上,仍生長良好,證明轉化子抗性基因能夠穩定遺傳。

圖1 轉化菌株的PCR鑒定結果Fig.1 The results of PCR identification for transformation strains

2.5 討論

環孢菌素A因其在器官移植和自體免疫疾病治療方面所起的重要作用,一直受到人們的重視,不斷提高其產量是工業化生產的重要目標。建立在隨機突變和大規模篩選基礎上的常規育種方法及培養工藝的改進在環孢菌素A產量的提高方面發揮了重大的作用,但隨著菌株產量的提高和突變的累積,傳統育種方法的局限性不斷顯現,進一步提高高產菌株的產量越來越困難。現代生物技術為菌種改良提供了更為直接和理性的方法。通過基因工程方法對工業微生物的改造,在放線菌和真菌上均有成功的報道[9-11],但基因工程技術在環孢菌素A生產菌改造方面應用的報道還很少。高效的轉基因體系是工業微生物基因工程育種的基礎。原生質體制備的預實驗中曾采用Weber等[13]報道的環孢菌素A生產菌的原生質體轉化系統,結果發現原生質體的制備量少,所需酶濃度高,而且在離心濃縮時,原生質體大部分懸浮在上清中,不易沉淀。經過多次實驗,對產黃青霉的原生質體制備及轉化體系[12]進行改良,確定了用于環孢菌素A高產菌株多孔木霉060901的原生質體制備及轉化方法,該方法所需酶濃度低,原生質體制備量大,成活率高。但與Weber等的報道相比,轉化效率還比較低,這可能與本研究選用的宿主為環孢菌素A高產菌株有關。本研究選用的質粒pPIPKA曾用于產黃青霉菌的轉化,可以成功地整合到多孔木霉基因組中,且經過多次傳代仍可以穩定地表達。由于該菌對腐草霉素比較敏感,使用較低濃度的腐草霉素便可篩選得到陽性克隆,與Weber等使用的潮霉素(600μg·m L-1)相比,是一種比較經濟的選擇。

3 結論

以腐草霉素抗性為選擇標記,建立了環孢菌素A高產工業菌株的基因轉化體系,成功將外源基因轉入環孢菌素A生產菌,并整合到染色體上。傳代實驗表明,外源基因可以穩定表達。為后續的環孢菌素A生產菌的基因工程育種奠定了基礎。

[1] Heuslera K,Pletscher A.The controversial early history of cyclosporine[J].Swiss Med Wkly,2001,131(21-22):299-302.

[2] Sowden J M,Allen B R.Cyclosporin in dermatology:A historical overview[J].Int J Dermatol,1992,31(7):520-523.

[3] Pritchard D I.Sourcing a chemical succession for cyclosporin from parasites and human pathogens[J].Drug Discovery Today,2005, 10(10):688-691.

[4] Lawen A,Zocher R.Cyclosporin synthetase:The most complex peptide synthesizing multienzyme polypeptide so far described [J].J Biol Chem,1990,256(19):11355-11360.

[5] Hoppert M,Gentzsch C,Sch?rgendorfer K.Structure and localization of cyclosporin synthetase,the key enzyme of cyclosporin biosynthesis in Tolypocladium inflatum[J].Arch Microbiol,2001, 176(4):285-293.

[6] Lee L,Agathos S N.Effect of amino acid on the production of cyclosporine A by Tolypocladium inflatum[J].Biotechnology Letters,1989,11(2):77-82.

[7] Balaraman K,Mathew N.Optimization of media composition for the production of cyclosporine A by Tolypocladium species[J]. Indian J Med Res,2006,123(4):525-530.

[8] Lee M J,Lee H N,Han K,et al.Spore inoculum optimization to maximize cyclosporin A production in Tolypocladium niveum[J]. J Microbiol Biotechnol,2008,18(5):913-917.

[9] Chiang S J.Strain improvement for fermentation and biocatalysis processes by genetic engineering technology[J].J Ind Microbiol Biotechnol,2004,31(3):99-108.

[10] Olano C,Lombo F,Mendez C,et al.Improving production of bioactive secondary metabolites in actinomycetes by metabolic engineering[J].Metabolic Engineering,2008,10(5):281-292.

[11] Crawford L,Stepan A M,Mcada P C,et al.Production of cephalosporin intermediates by feeding adipic acid to recombinant Penicillium chrysogenum strains expressing ring expansion activity [J].Biotechnology,1995,13(1):58-62.

[12] 王富強,任志紅,徐平,等.產黃青霉轉化載體pPIPKA的構建及青霉素工業生產菌株的轉化研究[J].菌物學報,2004,23(1):66-72.

[13] Weber G,Leitner E.Disruption of the cyclosporine synthetase gene of Tolypocladium niveum[J].Curr Genet,1994,26(5-6): 461-467.

Construction of Protoplasts Transformation System for Cyclosporin A Industrial Strain

DAI Meng,LIU Jing,ZHAO Ying,ZHANG Jia,ZHANG Li,ZHENG Gui-zhen
(New Drug R&D Center of North China Pharmaceutical Co.,National Engineering& Research Center of Microbial Medicine,Shijiazhuang 050015,China)

A protoplasts transformation system for high-productive industrial strain of cyclosporin A was successfully constructed by using phleomycin resistant gene as select marker.The PCR results proved that the foreign DNA had been integrated in the chromosome of T.inflatum and it could be expressed steadily after several generations.This system laid a foundation for genetic engineering breeding of the cyclosporin A-producing strain.

cyclosporin A;Tolypocladium inflatum;protoplasts transformation

Q 813

A

1672-5425(2013)03-0036-03

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.03.009

石家莊高端醫藥產業園創新藥物孵化基地資助項目(2011ZX09401-306)

2013-01-09

戴夢(1980-),男,上海人,工程師,研究方向:微生物功能基因組學及基因工程育種,E-mail:daimeng80927@2008.sina. com,daimeng80927@gmail.com;通訊作者:鄭桂珍,高級工程師。