β-4,4′-二羥基聯苯卟啉的合成及其生物活性研究

徐意祥,李 清,王司衛,黃齊茂,潘志權

(武漢工程大學綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室,湖北武漢430073)

β-4,4′-二羥基聯苯卟啉的合成及其生物活性研究

徐意祥,李 清,王司衛,黃齊茂,潘志權

(武漢工程大學綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室,湖北武漢430073)

以β-硝基四苯基金屬卟啉為原料,將4,4′-二羥基聯苯引入四苯基卟啉的β位得到一系列4,4′-二羥基聯苯卟啉,通過紫外光譜、紅外光譜、質譜及核磁共振氫譜等對該卟啉化合物進行了結構表征,并考察了其生物活性。結果表明,4,4′-二羥基聯苯引入到四苯基卟啉的β位,使其Soret帶一定程度上紅移;β-4,4′-二羥基聯苯卟啉具有明顯的產生單線態氧的能力;光照條件下,β-4,4′-二羥基聯苯卟啉對pBR322質粒DNA有明顯的切割作用;β-4,4'-二羥基聯苯卟啉可能是以外部自堆積的方式與CT-DNA發生作用的。

β-取代;卟啉;DNA切割

卟啉類化合物對腫瘤組織具有選擇性富集作用,在光照條件下能夠產生活化分子氧從而使其周圍腫瘤組織氧化以致壞死,該方法已被廣泛用于光動力療法(PDT)治療惡性腫瘤[1,2]。人工合成β-取代卟啉化合物的結構更接近天然卟啉的構象[3],使其具有更為特殊的光化學性質和生物學特性,因此,β-取代卟啉的合成研究對于PDT的廣泛應用具有重要的現實意義。4,4′-二羥基聯苯是一種常見的光敏材料中間體[4],作者在此將其引入四苯基卟啉(TPP)的β位合成了β-(4,4′-二羥基聯苯基)-5,10,15,20-四苯基卟啉,并對合成的卟啉化合物進行了結構表征和初步的生物活性測試[5]。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

柱層析硅膠(200～300目,100～120℃活化1 h),青島海洋化工廠;三羥甲基氨基甲烷-乙酸/鹽酸(TAE/TBE)緩沖溶液:0.05 mol·L-1Tris-HCl, 0.1 mol·L-1NaCl,p H值7.4;溴酚藍、溴化乙錠(EB)、瓊脂糖、p BR322質粒DNA,日本Toyobo公司;小牛胸腺DNA(CT-DNA)、1,3-二苯基異苯并呋喃(DPBF),華美生物工程公司。所用試劑均用標準方法純化。

LTQ XL型液相色譜-離子阱質譜色質聯用儀,美國Thermo公司;Agilent 400 MHz型核磁波譜共振儀,美國Agilent公司;FTIR-8100型紅外光譜儀、UV-2450型紫外可見分光光度計,日本Shimadzu公司;RY-1型熔點儀,天津市分析儀器廠;DYY-8B型穩流穩壓電泳儀,南京普陽科學儀器研究所;Lourmat Bio Print-1000型凝膠成像分析系統,法國Vilber公司;高壓汞燈(350～800 nm,50 W),西安教學儀器廠。

1.2 合成

原料4,4′-二羥基聯苯的合成參照文獻[6],β-(4, 4′-二羥基聯苯基)-5,10,15,20-四苯基卟啉的合成路線如圖1所示。

1.2.1 β-(4,4′-二羥基聯苯基)-5,10,15,20-四苯基銅卟啉(Ⅰ)的合成

在裝有回流冷凝管和氬氣進出口管的100 m L三口燒瓶中加入200 mgβ-硝基-5,10,15,20-四苯基銅卟啉和40 m L無水N,N-二甲基甲酰胺溶液,混合均勻,反應前通入高純氬氣,加熱至100℃回流;向反應瓶中加入20 mg氫氧化鈉和400 mg 4,4′-二羥基聯苯,用TLC(環己烷∶氯仿=1∶1)監測反應至無原料點,反應約2 h,停止加熱,冷卻至室溫;將反應混合物倒入到200 m L飽和氯化鈉冰水溶液中,攪拌均勻后抽濾,得到的固體物質溶解于氯仿中,濃縮,以硅膠作固定相、環己烷-氯仿(1∶1)作淋洗劑,進行柱層析分離,收集第3色帶(主帶)部分,濃縮,加入熱甲醇重結晶,得紫色晶體128 mg(0.15 mmol),產率55%。UV-Vis(CHCl3),λmax,nm:413,540;m.p.＞300℃; IR(KBr),υ,cm-1:3422、1597(C=C),3054、821、752 (Ar-H),1655(C=N),1222(C-O),1004(Cu-N); MS(FAB),m/z:860[M]+。

1.2.2 β-(4,4′-二羥基聯苯基)-5,10,15,20-四苯基鎳卟啉(Ⅱ)的合成

圖1 β-(4,4′-二羥基聯苯基)-5,10,15,20-四苯基卟啉的合成路線Fig.1 Synthetic route ofβ-(4,4′-dihydroxybiphenyl)-5,10,15,20-tetraphenylporphyrin

將200 mgβ-硝基-5,10,15,20-四苯基鎳卟啉加入100 m L三口燒瓶中,其它操作同上,得紫紅色晶體104 mg,產率54%。UV-Vis(CHCl3),λmax,nm:416, 531;m.p.＞300℃;1HNMR(400 MHz,CDCl3),δ: 8.72～8.17(m,7H,β-吡咯H),8.00～7.76(m,8H, 5,10,15,20-Ho),7.69～7.62(m,12H,5,10,15,20-Hm,p),7.42～7.40(m,7 H,4,4′-二羥基聯苯基H), 6.88～6.86(s,2H,OH);IR(KBr),υ,cm-1:3448 (C=C),3052(C-H),1597(C=C),1006(Ni-N), 834、793(Ar-H)。

1.3 產生單線態氧能力的測定

將待測1μmol·L-1卟啉溶液和100μmol·L-11,3-二苯基異苯并呋喃(DPBF)混溶于Tris-HCl緩沖溶液中,取3 m L混合溶液于比色皿中,用高壓汞燈照射混合液(距樣品20 cm),用紫外分光光度計檢測混合溶液在415 nm處吸光度值隨著時間的變化,以光照時間為橫坐標、吸光度為縱坐標作圖,比較卟啉產生單線態氧的能力。

1.4 切割pBR322質粒DNA的測定

在PE管中分別依次加入0.5μL卟啉溶液、0.5μL p BR322質粒DNA和1.5μL蒸餾水,混合均勻。用高壓汞燈光照(距樣品20 cm)混合溶液2 h,同時進行未光照的對比實驗,光照停止后每支PE管中加入0.5μL溴酚藍終止反應。在瓊脂糖凝膠(含0.1%EB)中點樣,以Tris-HCl-EDTA緩沖溶液為電泳液,在電壓90 V下電泳1.5 h,在凝膠成像系統上成像。

1.5 卟啉與CT-DNA滴定的紫外可見吸收光譜測定

在參比池和樣品池中分別加入3 m LTris-HCl緩沖溶液,同時在樣品池中加入3μmol卟啉溶液,使待測卟啉的濃度為1μmol·L-1。用紫外分光光度計記錄隨著CT-DNA濃度的增大,溶液在300～700 nm光譜范圍內其特征吸收峰的變化情況。

2 結果與討論

2.1 合成與表征

2.1.1 合成

β-硝基四苯基卟啉的β位引入4,4′-二羥基聯苯的反應屬于單分子自由基親核取代反應(SRN1)[7]。通入高純氬氣是防止原料和產品被氧化,加入少量的氫氧化鈉利于4,4′-二羥基聯苯形成酚氧負離子。產物采用柱層析分離方法提純,反應完成后將溶劑DMF除凈,得到的固體用氯仿溶解,抽濾除去不溶于氯仿的雜質,再將濾液濃縮的固體分離提純。由于產物存在兩個羥基,過柱時嚴重拖帶,以環己烷-氯仿(1∶1)為淋洗劑,柱中顏色明顯分帶:第1帶鮮紅色,為脫去硝基后的金屬四苯基卟啉;第2帶暗紅色,為未反應的β-硝基四苯基卟啉銅;第3帶(主帶)紅色,為產物帶,將第1帶和第2帶分離出來后改用氯仿將第3帶淋洗下來,即得到目標產物紫色固體。

2.1.2 紅外光譜分析

β-(4,4′-二羥基聯苯基)-5,10,15,20-四苯基卟啉的紅外光譜中,3488～3422 cm-1處強而寬的峰為C=C伸縮振動吸收峰,834～793 cm-1處中而尖銳的峰歸屬為苯環上C-H的面外振動彎曲吸收峰,1655～1597 cm-1處為C=N的伸縮振動峰,1004 cm-1和1006 cm-1處分別為Cu-N和Ni-N振動峰。以CDCl3為溶劑的1HNMR圖譜中,δ8.72～8.17處歸屬為吡咯環上的氫(7H),δ8.00～7.76和δ7.69～7.62處歸屬為卟啉中位苯環上的氫(20 H),δ7.42～7.40處歸屬為4,4′-二羥基聯苯基上的氫(7H),δ 6.88～6.86處為4,4′-二羥基聯苯基的羥基上的氫(2H)。

2.1.3 紫外可見吸收光譜分析

TPP和化合物Ⅱ的紫外可見吸收光譜見圖2。

圖2 TPP和化合物Ⅱ的紫外可見吸收光譜Fig.2 The UV-Vis absorption spectra of TPP and compoundⅡ

由圖2可知,化合物Ⅱ的紫外可見吸收光譜與四苯基卟啉相比較,其S帶和Q帶有不同程度的紅移。四苯基卟啉在結合了金屬離子之后,卟啉的環內電子云密度增大,共軛程度增強,整個體系的能量降低,分子更加穩定,使卟啉的Q帶數量減少;4,4′-二羥基聯苯取代卟啉環上的硝基使得整個卟啉共軛體系越長,其吸收越移往長波方向,說明4,4′-二羥基聯苯與卟啉環上基團相互作用,使得其Soret帶發生紅移。

2.2 產生單線態氧能力

單線態氧(1O2)是殺傷癌細胞和腫瘤組織的主要因素,因此卟啉化合物在光照條件下產生單線態氧的相對產量決定了其光敏能力的大小[8]。DPBF是常用的單線態氧捕獲劑,不同光照時間卟啉-DPBF混合溶液在415 nm處的吸光度值見圖3,由曲線的斜率即可判定卟啉化合物產生單線態氧的能力。

圖3 卟啉-DPBF混合溶液在不同光照時間的吸光度值Fig.3 The absorbance of porphyrin-DPBF solution at different light irradiation times

由圖3可知,化合物Ⅰ、Ⅱ的曲線斜率分別為-0.0023、-0.0082,表明β-(4,4′-二羥基聯苯基)-5, 10,15,20-四苯基卟啉均具有產生單線態氧的能力,其中化合物Ⅰ是順磁性金屬離子,使卟啉光敏反應中分子三線態壽命明顯降低,因此產生單線態氧能力較弱。

2.3 切割p BR322質粒DNA

pBR322質粒DNA以結構緊密的共價閉環超螺旋型(構型Ⅰ)為主,當與卟啉作用后,DNA雙鏈受到切割,產生結構松散的開環缺刻型(構型Ⅱ)和線型(構型Ⅲ)[9]。三種型態DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移速率為:構型Ⅰ＞構型Ⅱ＞構型Ⅲ[10]。不同濃度的化合物Ⅱ在光照和未光照的條件下對超螺旋p BR322質粒DNA的切割效果見圖4。

圖4 化合物Ⅱ在不同濃度下對超螺旋pBR322質粒DNA的切割Fig.4 Cleavage of supercoiled p BR322 plasmid DNA by compoundⅡwith different concentrations

由圖4可知,經過光照后,化合物Ⅱ具有切割DNA的作用,其對DNA的切割作用隨濃度的增大而增強,在濃度為600μmol·L-1時(Lane4)的切割效果最佳。

2.4 卟啉與CT-DNA滴定的紫外可見吸收光譜

紫外可見吸收光譜是研究化合物與DNA相互作用的最方便、常用的手段,紫外可見吸收光譜的變化是化合物與DNA結合的證據之一[11]。卟啉與DNA以插入方式作用時,紫外可見吸收光譜中卟啉的Soret帶會發生強烈的減色(＞35%)和紅移(＞15 nm);以外部溝面結合方式作用時,Soret帶會發生較小的減色(＜10%)和紅移(＜8 nm);以外部自堆積的方式作用時, Soret帶會發生強烈的減色和中等強度的紅移[12]。

CT-DNA滴定化合物Ⅱ的紫外可見吸收光譜見圖5。

圖5 CT-DNA滴定化合物Ⅱ的紫外可見吸收光譜Fig.5 The UV-Vis absorption spectra of compoundⅡ

由圖5可知,隨著CT-DNA濃度的不斷增大, Soret帶發生了較大的減色(約50%),但紅移不明顯(3 nm),推測化合物Ⅱ可能是以外部自堆積的外部結合方式與CT-DNA發生作用的。

3 結論

以β-硝基四苯基金屬卟啉為原料,將4,4′-二羥基聯苯引入四苯基卟啉的β位合成了β-(4,4′-二羥基聯苯基)-5,10,15,20-四苯基卟啉,β-4,4′-二羥基聯苯卟啉具有明顯的產生單線態氧的能力,在光照條件下對p BR322質粒DNA有明顯的切割作用,可能以外部自堆積的方式與CT-DNA發生作用。

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Research on Synthesis ofβ-4,4′-Dihydroxybiphenyl Porphyrins and Their Biological Activities

XU Yi-xiang,LI Qing,WANG Si-wei,HUANG Qi-mao,PAN Zhi-quan
(Key Laboratory for Green Chemical Process of Ministry of Education, Wuhan Institute of Technology,Wuhan 430073,China)

β-4,4′-Dihydroxybiphenyl porphyrins were synthesized by reaction ofβ-porphyrin with 4,4′-dihydroxybiphenyl directly,and structurally characterized by UV,1HNMR,IR and MS.Their biological activities were explored also.The results showed thatβ-4,4'-dihydroxybiphenyl porphyrins possessed remarkable ability to generate single line oxygen and to cleavage pBR322 plasmid DNA under light irradiation.Furthurmore,it maybe bind with CT-DNA in the mode of external self-accumulation.

β-substitute;porphyrin;DNA cleavage

O 626

A

1672-5425(2013)03-0027-04

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.03.007

國家自然科學基金資助項目(20471045),湖北省自然科學基金青年杰出人才項目(2008CDB072)

2012-11-29

徐意祥(1982-),男,湖北武漢人,碩士,助教,研究方向:藥物藥劑合成,E-mail:lengzhu520@163.com;通訊作者:黃齊茂,博士,教授,E-mail:huangqim@163.com。