介質泄漏對循環冷卻水中微生物多樣性的影響

董文文,劉 芳,仲慧赟,盧憲輝,陸津津

(中國石油大學(華東)化學工程學院,山東青島266580)

介質泄漏對循環冷卻水中微生物多樣性的影響

董文文,劉 芳,仲慧赟,盧憲輝,陸津津

(中國石油大學(華東)化學工程學院,山東青島266580)

以循環冷卻水作為接種水對生物粘泥進行培養,向循環冷卻水中加入柴油以模擬煉油廠中的介質泄漏現象,對介質泄漏影響下生物粘泥中的微生物進行微觀分析,利用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察生物粘泥內部的空間結構、緊密度等,利用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術,分析不同生物粘泥中的內部優勢菌種、微生物多樣性及相似性。SEM分析表明,與未投油的生物粘泥比較,投加0.3 g·L-1柴油時的生物粘泥內部結構復雜、緊密度好,而投加0.9 g·L-1柴油時的生物粘泥內部結構簡單、緊密度差。PCR-DGGE分析表明,與投加0.9 g·L-1柴油的生物污泥相比,投加0.3 g·L-1柴油的生物粘泥的細菌數量和種類更多,微生物多樣性更大,優勢菌種更多。

介質泄漏;生物粘泥;SEM;PCR-DGGE;微生物多樣性

煉油企業生產中的循環冷卻水由于長期的不斷蒸發、循環利用,導致其中滋生微生物,對煉油企業的日常生產造成一定的影響[1]。而煉油企業中的冷卻設備也會因為設備腐蝕、管線老化、密封技術落后等原因出現介質泄漏現象,泄漏的介質為循環冷卻水中的微生物提供了大量的碳源,導致微生物大量滋生、生物粘泥大量堆積,引起垢下腐蝕、換熱效率低下等一系列問題。目前,有效控制生物粘泥的方法很多[2],但大多數煉油企業通過投加殺菌劑來加以控制。

武獻春等[3]曾對石家莊焦化集團有限責任公司煤氣凈化分廠介質泄漏后的循環水進行水質分析,結果表明,循環水的濁度以及細菌量明顯增大,殺菌效率明顯降低。馬濤等[4]對不同營養水平下生物粘泥的優勢菌種進行了分析,結果表明,不同的營養水平下,生物粘泥中的優勢菌種不同,而且細菌群落結構差別較大。

目前,國內外對殺菌劑的研究都是針對正常的循環冷卻水,而對于介質泄漏影響下的殺菌劑尚無深入的研究。為此,作者采用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術,對介質泄漏影響下的生物粘泥進行分析,考察不同泄漏條件下的優勢菌種,擬為煉油企業選取有效的殺菌劑提供理論依據。

1 實驗

1.1 生物粘泥的培養

實驗裝置為RCC-Ⅱ型旋轉腐蝕掛片實驗儀,采用標準不銹鋼掛片(AISI304,50 mm×25 mm×2 mm)。采用定時排水濃縮法培養生物粘泥,控制水溫為(35±1)℃、p H值為7～8,加入一定量的培養液(葡萄糖作碳源、硫酸銨作氮源、磷酸氫二鈉作磷源,控制C∶N∶P為50∶10∶1),每隔12 h換水排掉懸浮態細菌,用自來水補充試液體積至刻度,以保證掛片表面的附著態細菌攝取充足養分,當生物粘泥長到穩定附著期時,向其中加入0 g·L-1、0.3 g·L-1、0.9 g· L-1的柴油,培養48 h。

1.2 掃描電子顯微鏡(SEM)分析

將附著粘泥的掛片放在燒杯中,用2.5%磷酸緩沖戊二醛固定液在4℃黑暗中固定24 h,然后依次用30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇和100%乙醇脫水10 min后自然干燥,鍍金觀察。

1.3 基因組DNA提取和純化

1.3.1 生物粘泥樣品的處理

取1 m L生物污泥于5000 r·min-1離心10 min。用400μL STET緩沖溶液重懸沉淀,將40μL 50 mg·mL-1的溶菌酶加到懸液中,室溫放置5min,然后94℃放置1min;加入10%SDS至終濃度為0.5%、20mg·mL-1蛋白酶K至終濃度為100μg·mL-1,混合后37℃下放置保溫1h[5]。

1.3.2 基因組DNA的提取[6]

向處理后生物粘泥樣品中加入5mol·L-1NaCl溶液至終濃度為0.5mol·L-1,充分混勻,再加入0.1BV的5%CTAB-NaCl溶液,混合,于65℃下放置保溫10min;加入1BV的飽和酚,混勻,于13000r· min-1離心10min,將上清液轉入另一潔凈的Eppendorf管中;加入1BV的酚-氯仿-異戊醇,混勻,于13000r·min-1離心10min,將水相轉入另一潔凈的Eppendorf管中;用1BV的氯仿抽提,于13000r· min-1離心10min,將上清液轉入另一潔凈的Eppendorf管中;加入0.1BV的2mol·L-1乙酸鈉和2BV的冷100%乙醇,混勻,-20℃下放置1h或過夜;于13000r·min-1離心10min,小心吸出或者倒出乙醇,用500μL70%冷乙醇洗滌沉淀,于13000r· min-1離心5min;小心吸出或者倒出乙醇,然后在吸水紙上倒置使殘余乙醇流盡,空氣干燥10～15min,以便表面乙醇揮發,注意不要使沉淀完全干燥;以50μLTE緩沖溶液重懸DNA沉淀,用微量移液器吹吸,混合至DNA充分溶解;分裝后于-20℃存放(不可使用自動除霜冰箱,以避免DNA反復冷凍)。

1.4 PCR擴增及純化

1.4.1 目的片段的擴增及檢測

以V2-V3區設計通用引物BSF338F和BSF518R[7]。

在冰浴及無菌條件下進行加樣操作。

PCR[8]擴增條件為:95℃預變性5min,94℃變性40s,56℃退火40s,72℃延伸40s,35個循環, 72℃最終延伸10min,4℃保存。

1.4.2 PCR產物的純化

用華舜膠回收試劑盒進行切膠回收目的片段并電泳檢測,若無雜帶則采用優化的PCR純化方法純化。

1.5 DGGE凝膠電泳

(1)采用Bio-Rad公司DcodeTM的基因突變檢測系統對PCR產物進行分離。

(2)使用梯度混合裝置,制備6%和8%的聚丙烯酰胺凝膠,變性劑濃度范圍40%～60%(100%的變性劑為7mol·L-1尿素-40%去離子甲酰胺),其中變性劑和聚丙烯酰胺的濃度從膠的上方向下方依次遞增。

(3)待變性梯度膠完全凝固后,將膠板放入裝有電泳緩沖溶液的電泳槽中,取6μLPCR樣品和6μL加樣緩沖溶液(6倍Loadingbuffer與去離子甲酰胺按1∶1混合)混合后加入上樣孔。

(4)用引物BSF338F/BSF518R擴增片段,在150V、60℃下電泳400min。電泳結束后,將凝膠進行銀染。

(5)用UMAXPowerLook1000型透射掃描儀掃描染色后的凝膠獲取膠圖。在分析后的凝膠兩面覆上干膠膜(Promega),用干膠夾定型,自然干燥后長期保存。

1.6 DGGE中特異條帶的回收、克隆、測序及分析

將DGGE中特異條帶及代表性的條帶切下,回收條帶并按文獻方法回收單鏈DNA。以回收的DNA為模板,用相同的引物(不帶GC夾),按1.4方法進行PCR擴增,準備克隆測序。

1.7 連接與轉化

(1)在微量離心管(PCR管)中配制下列DNA溶液,總量為5μL:PMD19-T或PMD19-TVector 1μL,DNAsolution4μL;

(2)加入5μL(等量)的LigationMix;

(3)16℃連接9h;

(4)全量10μL加至100μL感受態細胞中,冰浴30min;

(5)42℃水浴105s后,再冰浴3min;

(6)加入890μLSOC培養基,于37℃、75r· min-1下培養60min;

(7)配制LB/Amp/IPTG/X-Gal固體培養基(大平板需要50mL培養基,小平板需要20mL培養基)。在1LLB固體培養基中加入1mLAmp、1mLIPTG和2mLX-Gal,用20μL培養液涂平板,37℃下倒置培養過夜,形成單菌落。記數白色、藍色菌落。

1.8 檢測

(1)向LB液體培養基中加入Amp,分裝到離心管中;

(2)用通用引物M13R和M13F作菌落PCR;

(3)挑取白色菌落至PCR管和離心管;

(4)離心管于37℃下培養,PCR反應陽性者測序。

1.9 PCR-DGGE譜圖分析

1.9.1 Shannon-Weiner指數

利用生態學的生物多樣性指數Shannon-Weiner指數H[9]對DGGE條帶所表示的微生物種群的多樣性進行表征,H數值越大,表明未確定性越大,種群多樣性越高[10]。以Quantity One軟件對不同樣品DGGE圖譜進行條帶掃描及識別,得出不同條帶的數目及其相應的吸收峰值。將其條帶數目及各自的吸收峰面積等參數導入Excel,按以下公式計算不同樣品的H值:

式中:H為Shannon-Weiner指數;s為每條泳帶中條帶總數;ni為單一條帶i的峰面積;N為所有峰的總面積;pi為特定條帶亮度相對于所有條帶總亮度的比率。

1.9.2 豐富度指數

物種豐富度指數S為DGGE圖譜中優勢條帶的總數,可認為DGGE圖譜中每個條帶都對應著一種細菌。

1.9.3 均勻度指數

均勻度指數EH(又稱PieLou指數)是測量群體中個體數在各物種上的分配狀況的指標,其大小表明群體中物種的均勻度關系。均勻度指數越高,表明各個物種分配得越均勻。其計算公式如下:

2 結果與討論

2.1 生物粘泥群落結構分析

挑選生長至穩定期的生物粘泥共3組:第1組為不投加柴油的自然生長的生物粘泥樣品、第2組為投加0.3 g·L-1柴油的生物粘泥樣品、第3組為投加0.9 g·L-1柴油的生物粘泥樣品,用S-4800型冷場掃描電鏡進行掃描,觀察生物粘泥的微觀結構,如圖1所示。

圖1 生物粘泥放大900倍(a、b、c)和放大7000倍(a′、b′、c′)的SEM照片Fig.1 SEM Images of slime magnified by 900 folds(a,b,c)and 7000 folds(a′,b′,c′)

由圖1可知,不投油時,生物粘泥比較疏松,緊密度較差,呈現分散生長的狀態;投油之后,生物粘泥粘滯性增強,結構變成較大的塊狀,當投油量為0.3 g· L-1時,生物粘泥塊狀結構較大,粘結性較好、緊密度較好;而投油量為0.9 g·L-1時,生物粘泥分散為小塊,粘結性和緊密度很差。這是由于,柴油的加入為微生物提供了大量的碳源,促進了微生物的生長,微生物在生長過程中會向外界分泌粘性物質,這些粘性物質會將微生物以及水環境中的懸浮物質聚集在一起,形成較大的塊狀結構。同時,生物粘泥的胞外聚合物(EPS)中含有脂類、蛋白質等疏水分子,可使污泥表面呈局部疏水性,還含有能與二價陽離子結合的陰離子基團,可以在顆粒間起到架橋作用,而EPS的含量在投油量為0.3 g·L-1時達到最大值,加之柴油的粘滯性,此時生物粘泥之間聚集成的塊狀結構最大;隨著投油量增加至0.9 g·L-1時,生物粘泥中的EPS含量減少,架橋作用減弱,而柴油粘附在微生物表面上形成的油膜越來越厚,阻礙溶解氧的進入,油層下的微生物就處于缺氧的狀態,使微生物的生長受到抑制。

2.2 PCR-DGGE分析

選取柴油投加量為0.3 g·L-1和0.9 g·L-1時的生物粘泥樣品進行PCR-DGGE分析。

將生物粘泥樣品提取到的DNA的TE溶液進行瓊脂糖凝膠電泳,結果如圖2所示。

圖2 生物粘泥樣品基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Genome DNA agarose gel electrophorogram of slime samples

由圖2可知,樣品總基因組片段的亮度和純度都較好,沒有出現拖尾現象,說明DNA的提取效果良好。

將生物粘泥樣品的16S rDNA片段的PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳,結果如圖3所示。

圖3 生物粘泥樣品PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 PCR Amplification product agarose gel electrophorogram of slime samples

由圖3可知,生物粘泥樣品的16S r DNA片段PCR擴增條帶亮度和純度都比較好,未出現非特異性擴增。通過與DNA Marker(DI2000)對比,得到其片段大小約為200 bp,且陰性對照未有產物出現,說明PCR擴增效果良好,可進行DGGE分析。

測試生物粘泥樣品的16S rDNA片段擴增產物的DGGE分離譜圖,利用Quantity One(v4.62,Bio-Rad)軟件掃描2條泳道,選取適當的條帶檢測靈敏度、條帶邊界靈敏度、降噪度等參數后得到條帶分布模式,并得出對應的量化后各個條帶的峰密度值,結果如圖4所示。

圖4 生物粘泥樣品的PCR產物的DGGE分離譜圖(a)及其對應的分布模式(b)和量化后的峰密度值分布(c)Fig.4 DGGE Separation pattern(a)and the corresponding distribution mode(b)and peak density value distribution after quantification(c)of PCR product

2.3 介質泄漏影響下生物粘泥細菌群落多樣性分析

根據電泳圖譜中每個條帶的強度,計算生物粘泥樣品的細菌Shannon-Weiner指數(H)、豐富度指數(S)和均勻度指數(EH),結果如表1所示。

表1 生物粘泥樣品的Shannon-Weiner指數、豐富度指數及均勻度指數Tab.1 Shannon-Weiner index,richness index and evenness index of slime samples

由表1可知,投油量為0.3 g·L-1時生物粘泥樣品的Shannon-Weiner指數、豐富度指數及均勻度指數均大于投油量為0.9 g·L-1時。這說明投油量為0.3 g·L-1時生物粘泥中的細菌種類更多、分布也更均勻。

環境條件的差異會引起細菌種群結構發生變化,在同一系統中,附著態與懸浮態細菌的優勢菌群結構也可能不盡相同。本實驗過程中,水溫、p H值、水力剪切力等條件始終保持一致,因此可以認為柴油的投加量是導致生物粘泥中細菌種群結構與多樣性變化的決定性因素。由于柴油的投加量會影響水體中營養碳源的含量、溶解氧的濃度和水質,而不同種類微生物對營養物質的親和力與競爭能力、對氧氣的需求和對水體環境變化的適應性存在差別,因此不同的投油量會引起細菌數量及EPS濃度[11]的變化,進而改變生物粘泥的空間結構,粘泥內部會出現不同程度的缺氧或厭氧層,部分細菌的生長繁殖受其周圍微環境的影響而此消彼長,導致生物粘泥的優勢菌種組成及多樣性產生差異[12]。

2.4 介質泄漏影響下生物粘泥中優勢菌種的鑒定

選取圖4中14個條帶進行切膠測序,并應用GenBank的BLAST程序將測得的DNA序列與Gen-Bank數據庫中已登錄的序列進行同源性檢索和比對,以確定目標菌種的歸屬,結果如表2所示。

表2 DGGE譜圖優勢條帶基因片段序列比對結果Tab.2 Advantage stripe gene fragment sequence comparison results of DGGE

由表2可知,實驗所測各個條帶與其對應的Gen-Bank中最相近的菌種的DNA序列同源性均在94%以上[13],其中條帶1、3、4、6、8分別與Uncultured Pedomicrobium sp.、Arthrobacter sp.4-83(2012)、Microbacterium sp.enrichment culture clone WW1_3-78、Stenotrophomonas sp.AR36、Rhodanobacter sp. IMER-B2-16的同源性甚至達到100%。由表2還可知,鑒定出的菌種中有3種是不可培養細菌(Uncultured bacterium),可見,PCR-DGGE技術的運用能夠有效避免傳統分離培養使用的培養基營養結構單一、無法滿足環境樣品中微生物需求的局限性,從而提高了鑒定結果的完整性和準確性。

依據伯杰氏細菌鑒定手冊[14]對每個條帶所代表的優勢菌種進行科屬鑒定,結果如表3所示。

表3 DGGE譜圖中不同條帶代表的生物粘泥中的優勢菌種鑒定結果Tab.3 The identification of the dominant species in slime represented by different stripes of DGGE

綜合分析圖4、表2、表3結果可知,不同投油量水平下,生物粘泥中的優勢菌種存在較大差別。例如,在投油量為0.3 g·L-1的生物粘泥中,柴油作為生物粘泥營養碳源的促進作用占優勢,水體中的氧含量也降低不大,假單胞菌屬細菌是嚴格需氧的革蘭氏染色陰性無芽孢桿菌,這類細菌的生長溫度范圍廣,對營養要求不高,因此可成為生物粘泥中的優勢菌種。而在投油量為0.9 g·L-1時,柴油阻止空氣進入水體的抑制作用造成粘泥內部出現不同程度的缺氧甚至厭氧區域,限制了假單胞菌屬的生長繁殖[15],因此在投油量為0.9 g·L-1的循環冷卻水中,假單胞菌屬細菌無法成為生物粘泥中優勢菌種。

3 結論

以循環冷卻水作為接種水對生物粘泥進行培養,向循環冷卻水中加入柴油以模擬煉油廠中的介質泄漏現象,對介質泄漏影響下生物粘泥中的微生物進行微觀分析。SEM分析表明,與未投油的生物粘泥比較,投加0.3 g·L-1柴油時的生物粘泥內部結構復雜、緊密度好,而投加0.9 g·L-1柴油時的生物粘泥內部結構簡單、緊密度差。PCR-DGGE分析表明,與投加0.9 g·L-1柴油的生物污泥相比,投加0.3 g·L-1的生物粘泥的細菌數量和種類更多,微生物多樣性更大,優勢菌種更多。

[1] 郭景玉,范永雁,楊忠.泄漏狀況下煉油循環水系統的粘泥控制[J].石油化工安全環保技術,2007,23(1):42-44.

[2] 劉稚紅,董濱.循環冷卻水系統中生物粘泥的控制途徑[J].中國給水排水,2008,24(12):22-26.

[3] 武獻春,李文立.循環水系統點蝕與微生物粘泥的綜合治理[J].河北化工,2003,(5):55-56.

[4] 馬濤,劉芳,趙朝成,等.循環水系統黏泥細菌群落結構多樣性的PCR-DGGE分析[J].石油學報(石油加工),2011,27(3):493-500.

[5] 陶芳,黃燕,高尚,等.PCR-DGGE法分析溫度對A2/O系統硝化菌群結構的影響[J].華東師范大學學報(自然科學版),2009, (5):53-62.

[6] Ying Y L,LüZ M,Min H L,et al.Dynamic changes of microbial community diversity in a photohydrogen producing reactor monitored by PCR-DGGE[J].Journal of Environmental Sciences, 2008,20(9):1118-1125.

[7] 梁新樂,朱揚玲,蔣予箭,等.PCR-DGGE法研究泡菜中微生物群落結構的多樣性[J].中國食品學報,2008,8(3):133-137.

[8] Hesham Abd El-Latif,Qi Rong,Yang Min.Comparison of bacterial community structures in two systems of a sewage treatment plant using PCR-DGGE analysis[J].Journal of Environmental Sciences,2011,23(12):2049-2054.

[9] Ahn C,Gillevet P M,Sikaroodi M.Molecular characterization of microbial communities in treatment microcosm wetlands as influenced by macrophytes and phosphorus loading[J].Ecological Indicators,2007,7(4):852-863.

[10] Graham M H,Haynes R J.Catabolic diversity of soil microbial communities under sugarcane and other land uses estimated by biolog and substrate-induced respiration methods[J].Applied Soil Ecology,2005,29(2):155-164.

[11] Sim?es M,Pereira M O,Sillankorva S,et al.The effect of hydrodynamic conditions on the phenotype of Pseudomonasfluorescens biofilms[J].Biofouling,2007,23(3-4):249-258.

[12] Khoyi M R,Yaghmaei S.Simulation of competition between two microorganisms in a biofilm reactor based on different growth models[J].Biochemical Engineering Journal,2005,23(1):63-72.

[13] Stackebrandt E,Goebel B M.Taxonomic note:A place for DNADNA reassociation and 16S r RNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology[J].International Journal of Systematic Bacteriology,1994,44(4):846-849.

[14] Garrity G M,Bell J A,Lilburn T M.Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology(Second edition)[M].Heidelberg:Springer, 2004:4-10.

[15] 丁峰,王淑瑩,李秀瑋,等.缺乏營養物質(N、P等)引起的污泥膨脹及其控制[J].哈爾濱建筑大學學報,2001,34(5):59-63.

The Effect of Medium Leakage on the Microbial Diversity of Circulating Cooling Water

DONG Wen-wen,LIU Fang,ZHONG Hui-yun,LU Xian-hui,LU Jin-jin
(College of Chemical Engineering,China University of Petroleum,Qingdao 266580,China)

The slime was cultured with the circulating cooling water as the inoculated water,adding diesel to analog medium leakage of refineries.Microorganisms in the slime under the influence of medium leakage were analyzed,and the structure,density,thickness and compactness inside the slime were observed with scanning electron microscope(SEM).The dominant species,microbial diversity and similarity of different slimes were analyzed by using polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis(PCR-DGGE).The SEM results showed that campared with the slime without adding diesel,the slime adding 0.3 g·L-1of diesel had complex structure and higher compactness,but the slime adding 0.9 g·L-1of diesel had simple structure and lower compactness.The PCR-DGGE result showed that,quantity and types of bacteria,the microbial diversity and the dominant species amount of the slime adding 0.3 g·L-1of diesel were all superior to those of that adding 0.9 g·L-1of diesel.

medium leakage;slime;SEM;PCR-DGGE;microbial diversity

Q 938.15

A

1672-5425(2013)03-0021-06

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.03.006

國家自然科學基金資助項目(21077133),中央高校基本科研業務費專項資金資助項目(11CX06045A)

2012-12-06

董文文(1987-),女,山東人,碩士研究生,研究方向:水污染控制與資源化利用,E-mail:wenchang13@126.com;通訊作者:劉芳,副教授,E-mail:liufangfw@163.com。