鈷(Ⅱ)對纖維蛋白原硝化損傷及活性的影響研究

丁 楊,羅云敬,史建龍,徐世奎

(北京工業大學,北京100124)

鈷(Ⅱ)對纖維蛋白原硝化損傷及活性的影響研究

丁 楊,羅云敬,史建龍,徐世奎

(北京工業大學,北京100124)

以纖維蛋白原為研究對象,運用紫外分光光度法、三維熒光光譜法、SDS-PAGE和Von-Clauss法研究了Co (Ⅱ)參與過氧亞硝酸根(ONOO-)介導的纖維蛋白原硝化反應過程。結果表明,Co(Ⅱ)對ONOO-硝化損傷纖維蛋白原存在明顯的促進作用,并加劇了硝化損傷后纖維蛋白原凝聚活性的下降。

過氧亞硝酸根;纖維蛋白原;Von-Clauss法;鈷(Ⅱ)

纖維蛋白原(Fibrinogen,Fg)是一種可溶于水的糖蛋白,每個纖維蛋白原分子由3對非等同的多肽鏈Aα、Bβ和γ構成[1,2],易被氧化硝化,它的損傷可導致體內的血粘度升高,血小板聚集性增強,冠狀動脈血栓發生率增加,促進冠狀動脈粥樣硬化[3-5]。過氧亞硝酸根離子(ONOO-)具有很強的硝化和氧化能力,可以在生理或病理條件下,對蛋白質進行翻譯后修飾[6]。這種修飾可造成蛋白質的硝化進而導致變性,產生一系列的細胞毒性作用,最終可能引發疾病,如心血管疾病、帕金森癥等等[7,8]。鈷是生物體內存在的重要且必需的微量金屬元素,能刺激人體骨髓的造血系統,并與心血管疾病有著一定的聯系。有報道表明鈷可以催化芳香類化合物的硝化[9,10]。鑒于鈷元素的重要生物功能,作者對Co(Ⅱ)參與的ONOO-硝化損傷纖維蛋白原殘基過程進行了研究并對硝化損傷后纖維蛋白原的生物活性進行了評價,對于揭示ONOO-的生理作用機制,了解相關疾病的發病機理并進行預防和治療有著重要意義。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

纖維蛋白原、凝血酶,美國Sigma公司。ONOO-溶液按照1995年Uppu等[11]提出的兩相反應體系過氧化氫與亞硝酸異戊酯的取代反應制備。每次實驗前用紫外可見分光光度計在302 nm處測定ONOO-的吸光度,根據ε302=1670 L·mol-1·cm-1計算ONOO-濃度。實驗用水為二次去離子水,其它常用試劑均為分析純或電泳級。

U3010型紫外可見分光光度計、F4500型熒光分光光度計,日本日立公司;DYY-12C型電泳儀,北京六一儀器廠。

1.2方法

1.2.1 紫外分光光度法

將纖維蛋白原溶于0.1 mol·L-1的PBS緩沖溶液(p H值7.4)中,37℃下孵育5 min。將ONOO-以0.018 mmol·L-1·min-1的恒定速率(ONOO-終濃度為0.53 mmol·L-1)注入到不斷攪拌的纖維蛋白原溶液(1 mg·m L-1,37℃)中反應30 min。在反應體系中分別加入0μL、5μL、10μL、15μL、20μL、25μL濃度為10 mmol·L-1的CoCl2溶液[即反應體系中CoCl2終濃度(mmol·L-1)分別為0、0.017、0.03、0.05、0.067、0.083],反應前后體系p H值變化不超過0.1個p H單位。隨后測定反應體系在360 nm處的紫外吸光度值(纖維蛋白原修飾產物3-NTyr在360 nm處有最大吸收ε=4400 L·mol-1· cm-1)。

1.2.2 三維熒光光譜法

在比色管中加入纖維蛋白原溶液,再分別加入0μL、5μL、10μL、15μL和20μL濃度為10 mmol· L-1的CoCl2溶液[即反應體系中CoCl2終濃度(mmol ·L-1)分別為0、0.017、0.03、0.05、0.067]。隨后以0.018 mmol·L-1·min-1的速率向比色管中加入ONOO-至終濃度為0.53 mmol·L-1,恒溫37℃下反應30 min。反應結束靜置10 min后進行三維熒光分析。

1.2.3 SDS-PAGE電泳

將纖維蛋白原溶于0.1 mol·L-1的PBS緩沖溶液(p H值7.4)中,加入0μL、5μL、10μL、15μL、25μL和30μL 10 mmol·L-1的CoCl2溶液[即反應體系中CoCl2終濃度(mmol·L-1)分別為0、0.017、0.03、0.05、0.083、0.1],與ONOO-反應5 min,測硝化纖維蛋白原的電泳圖。采用12%的分離膠和5%的濃縮膠,上樣后,設置起始電壓為100 V,待指示前沿到達分離膠后調節電壓為120 V。當前沿指示距底端約1 cm時,切斷電壓。染色1 h,脫色至背景色完全消失。

1.2.4 Von-Clauss法

將凝血酶均勻溶于0.05 mol·L-1的CaCl2溶液中,使其活力為100 U·m L-1;37℃水箱孵育5 min后,以1∶1(體積比)的比例向纖維蛋白原的反應溶液中加入凝血酶,用Von-Clauss法檢測其凝聚時間。具體如下:在加入凝血酶后,用帶鉤的小棒以每分鐘1次的固定速度上下鉤動溶液,當出現明顯纖維絲和凝聚塊時,記錄時間,每個樣品進行3組平行實驗。

2 結果與討論

2.1 紫外分光光度法檢測Co(Ⅱ)對纖維蛋白原硝化損傷的作用(圖1)

由圖1可知,隨著反應體系中CoCl2濃度由0逐漸增大到0.083 mmol·L-1,3-NTyr的生成量也不斷增多,體系在360 nm處的紫外吸光度值由最初的1.067逐漸增大到1.764,增幅65.3%。表明Co(Ⅱ)促進了3-Ntyr的生成,即Co(Ⅱ)在ONOO-硝化損傷纖維蛋白原的反應中起到了正向的促進作用。

2.2 三維熒光法檢測Co(Ⅱ)對纖維蛋白原硝化損傷的作用(圖2)

圖2 Co(Ⅱ)存在下ONOO-損傷纖維蛋白原的三維熒光光譜Fig.2 3D-Fluorescence spectra of fibrinogen treated by ONOO-in the presence of Co(Ⅱ)

蛋白質受激發能夠產生熒光,其熒光值不僅決定于蛋白質本身,也與蛋白質所處微環境相關,二者的變化都能引起蛋白質熒光值的變化。由圖2可知,1 mg ·m L-1的纖維蛋白原未硝化原液在Ex=280 nm、Em=340 nm左右有較強的熒光峰,峰值為1035,在Ex= 270 nm、Em=320 nm左右有一較弱的熒光峰,峰值為762。初步判斷這兩個峰分別為色氨酸和酪氨酸。隨著反應體系中Co(Ⅱ)濃度的逐漸增大,兩個熒光峰峰值呈現連續下降的趨勢,當Co(Ⅱ)的濃度為0.067 mmol·L-1時,其熒光峰峰值為642和423,較纖維蛋白原原液分別下降了37.9%和44.5%。硝化損傷后纖維蛋白原熒光值的下降,是因為加入ONOO-后,使纖維蛋白原產生修飾產物3-NTyr、色氨酸發生硝化,改變了蛋白質所處的微環境,使得纖維蛋白原的熒光發生猝滅,熒光強度下降。在反應體系中加入Co (Ⅱ)并增大其濃度,促進了3-NTyr的生成并進一步改變纖維蛋白原所處微環境,使其熒光值持續下降。進一步驗證了Co(Ⅱ)對于ONOO-硝化損傷纖維蛋白原起到促進作用,Co(Ⅱ)濃度越大,促進作用越明顯,兩者之間呈正相關。

2.3 SDS-PAGE檢測Co(Ⅱ)對纖維蛋白原硝化損傷的作用(圖3)

圖3 Co(Ⅱ)存在下ONOO-損傷纖維蛋白原的SDS-PAGE圖譜Fig.3 SDS-PAGE Electrophorogram of fibrinogen treated by ONOO-in the presence of Co(Ⅱ)

由圖3可知,纖維蛋白原在電泳圖上均出現了3條明顯的條帶,至上而下分別為纖維蛋白原Aα(66 k Da)、Bβ(52 k Da)和γ(46 k Da),相對于纖維蛋白原的原液來說,隨著Co(Ⅱ)濃度的增大,肽鏈損傷明顯,其中γ鏈最先變淺。表明Co(Ⅱ)的加入,加重了ONOO-對纖維蛋白原氨基酸的硝化損傷,使纖維蛋白原結構中γ鏈首先受損,α鏈次之受損。

2.4 Co(Ⅱ)對ONOO-損傷纖維蛋白原凝聚活性的影響

在反應體系中分別加入0μL、5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL的10 mmol·L-1CoCl2溶液,硝化后用Von-Clauss法檢測纖維蛋白原凝聚活性,結果見圖4。

圖4 Co(Ⅱ)存在下ONOO-對纖維蛋白原凝聚活性的影響Fig.4 The clotting activity of fibrinogen treated by ONOO-in the presence of Co(Ⅱ)

由圖4可知,纖維蛋白原凝集成絲的時間分別為9 s、11 s、13 s、15 s、17 s、20 s、22 s,成絲后再凝集成塊的時間分別12 s、17 s、20 s、22 s、25 s、27 s、29 s。在硝化相同時間下,纖維蛋白原的凝聚活性隨著Co(Ⅱ)添加量的增加而不斷降低,當加入45μL時,能看到少許的細絲,但無法在凝血酶的作用下形成凝膠,失去了凝聚活性,而對照實驗中Co(Ⅱ)本身并不能與纖維蛋白原發生作用。這表明,Co(Ⅱ)在ONOO-損傷纖維蛋白原的過程中表現出了促進作用,并且纖維蛋白原的凝聚活性與Co(Ⅱ)的添加量呈負相關。

3 結論

選用人體正常濃度范圍內的Co(Ⅱ),較好地模擬了Co(Ⅱ)存在于體內時ONOO-損傷纖維蛋白原的情況。Co(Ⅱ)對纖維蛋白原的硝化損傷有催化作用,促進纖維蛋白原產生修飾產物3-NTyr,Co(Ⅱ)濃度與硝化損傷程度呈正相關;在Co(Ⅱ)的促進作用下, ONOO-首先損傷纖維蛋白原的γ鏈;隨著反應時間的延長,纖維蛋白原的凝聚活性逐漸降低,并且在Co (Ⅱ)添加量達到一定程度時完全失去了凝聚能力。

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Study on Influence of Co(Ⅱ)on Nitration Damage of Fibrinogen and Its Activity

DING Yang,LUO Yun-jing,SHI Jian-long,XU Shi-kui
(Beijing University of Technology,Beijing 100124,China)

Taking fibrinogen as the object,its nitration reaction process via ONOO-in the presence of Co (Ⅱ)was investigated through ultraviolet spectrometry,3D-fluorescence spectrum,SDS-PAGE and Von-Clauss method.The results showed that Co(Ⅱ)promoted remarkably the fibrinogen nitration damage by ONOO-, and enhanced the clotting activity decrease of the fibrinogen damaged.

peroxynitrite(ONOO-);fibrinogen;Von-Clauss method;Co(Ⅱ)

O 611.62 Q 51

A

1672-5425(2013)03-0017-04

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.03.005

國家自然科學基金資助項目(20875006),北京市自然科學基金資助項目(2102005),北京市教委科技面上項目(KM201210005032)

2013-01-10

丁楊(1987-),男,湖北襄陽人,碩士研究生,研究方向:生物化學與分子生物學;通訊作者:羅云敬,教授,E-mail:luoyj@ bjut.edu.cn。