產纖維素酶細菌的篩選及其紫外誘變

張學佳,田 云,盧向陽

(1.湖南農業大學生物科學技術學院,湖南長沙410128;2.湖南省農業生物工程研究所,湖南長沙410128)

產纖維素酶細菌的篩選及其紫外誘變

張學佳1,2,田 云1,2,盧向陽1,2

(1.湖南農業大學生物科學技術學院,湖南長沙410128;2.湖南省農業生物工程研究所,湖南長沙410128)

采用剛果紅脫色圈法初篩得到143株有纖維素酶活性的細菌,然后采用DNS法復篩得到纖維素酶酶活最高的6株細菌,進一步進行紫外誘變處理,獲得酶活提高最大且具有遺傳穩定性的菌株E140′,酶活為0.90 IU·m L-1,較出發菌株(0.68 IU·m L-1)提高了32.35%。表明采用剛果紅脫色圈法和DNS法聯合篩選并結合紫外誘變,可以獲得纖維素酶活性高的細菌。

剛果紅;DNS;紫外誘變;纖維素酶

纖維素酶可以將纖維素降解為小分子糖,甚至單糖(葡萄糖等),實現廢物利用。獲得更高活性的纖維素酶,能大幅降低成本,改進工藝流程[1-3],將對生物質能源、造紙、發酵、紡織、洗滌等行業產生巨大影響。

自然界生物種類繁多,天然的纖維素酶種類及數量龐大,其活性也各不相同。如何快速有效地篩選獲得高活性的纖維素酶及產酶菌株成為了研究的熱點。

1 實驗

1.1 菌種與培養基

細菌菌種來自于黃牛的牛糞及牛胃內容物、黑山羊羊糞、腐木木屑、多年生喬木根系附近的土壤。

CMC-Na篩選培養基(g·L-1):CMC-Na 5,蛋白胨10,氯化鈉10,酵母提取物5,瓊脂糖12。

細菌產酶培養基(g·L-1):麩皮40,蛋白胨20, K2HPO410,酵母提取物4。

1.2 方法

1.2.1 剛果紅脫色圈法初篩[4-7]

取細菌菌種1 m L接入裝有CMC-Na篩選培養基的培養皿中,置于37℃恒溫培養箱靜置培養8 h后,每小時觀測1次,待細菌長到直徑約0.3～2 cm時,取出培養皿。倒入1%剛果紅染液靜置1 h,倒掉染液。倒入1 mol·L-1的氯化鈉溶液靜置0.5 h,倒掉氯化鈉溶液,觀察有無脫色圈。如果該細菌能分泌纖維素酶,則有脫色圈;反之,則無。

1.2.2 DNS法復篩[8]

(1)細菌粗酶液的制備:取活化的菌種接入裝有細菌產酶培養基的三角瓶中,于37℃、140 r·min-1搖床培養48 h。取1 m L培養液,4000 r·min-1離心10 min。取0.5 m L上清液,即為粗酶液。

(2)采用DNS法,在波長為540 nm處測定一系列已知濃度葡萄糖的OD值,繪制葡萄糖標準曲線。

(3)酶活的測定:取適當稀釋的粗酶液0.5 m L于15 m L刻度試管中,加1.5 m L蒸餾水,另取一份置于沸水浴10 min滅活作對照。加DNS試劑3.0 m L, 50℃水浴30 min,沸水浴5 min,冷卻后用水補足到10 m L,在540 nm波長下測定OD值。依據標準曲線方程求出葡萄糖濃度(μmol·m L-1),計算粗酶液中糖含量,并按下式計算酶活:

酶活定義:在自然p H值條件下,1 m L酶液水解底物1 min產生1μmol還原糖所用的酶量為1個酶活力單位(IU·m L-1)。

1.2.3 紫外誘變

取對數生長期的細菌,在顯微鏡下用血細胞計數器計細菌個數,稀釋至細菌濃度為1×108個·m L-1。取稀釋菌液分別紫外誘變處理0 s、15 s、30 s、45 s、60 s、75 s、90 s、105 s、120 s、135 s、150 s,繪制致死率曲線。

以致死率75%～90%之間的時間作為最佳誘變時間,對復篩得到的菌株進行紫外誘變。將誘變菌株進行剛果紅脫色圈篩選[9,10]。取脫色圈大的菌株用DNS法檢測酶活,并將酶活提高的菌株添加50%甘油保存于-20℃冰箱。

1.2.4 酶活穩定性鑒定[10,11]

取誘變后粗酶活最高的6株菌,活化。傳代一定代數以后開始標記為0代,以0代為起點接種產生的下一批菌種為第1代,然后以第1代接種產生第2代,如此類推,直到產生第5代菌株,測定各代菌株的粗酶活。

2 結果與討論

2.1 初篩結果

由于細菌將酶分泌到培養基中,因此脫色圈的大小一定程度上與酶的擴散程度相關,受時間影響(圖1)較大。從圖1可以看出,點樣5 d后的脫色圈直徑大于點樣3 d后的脫色圈直徑。另一方面,由于細菌菌落增長速度和脫色圈變大速度的不一致(甚至有時菌落長大到一定程度就幾乎不再增大),采用菌落直徑與脫色圈直徑的比值作為酶活高低評判的方式也存在一定的理論缺陷。采用剛果紅脫色圈法篩選得到143株有剛果紅脫色圈的細菌菌株。部分初篩結果見表1。

圖1 時間對脫色圈的影響Fig.1 The influence of time on the decolorizing circle

表1 部分初篩實驗結果Tab.1 Part of primary screening results

2.2 復篩結果

對初篩得到的143株菌進行DNS法復篩,最終選擇DNS法測得的酶活最高的6株菌株(表1)進行紫外誘變實驗。

2.3 紫外誘變結果

紫外照射時間與致死率的關系曲線見圖2。

圖2 紫外照射時間與致死率的關系Fig.2 The relationship between the ultraviolet irradiation time and the fatality rate

從圖2可以看出,紫外照射超過120 s以后,致死率接近100%,一般選擇致死率在75%～90%之間進行紫外誘變,本實驗選取致死率為83.5%的90 s作為最佳誘變時間。

將復篩得到的6株菌分為6組分別紫外誘變處理90 s,將各組酶活最高的誘變菌株分別命名為D1′、A83′、E140′、E17′、D22′、B4′,紫外誘變前后細菌酶活對比見表2。

表2 紫外誘變前后細菌酶活對比/IU·mL-1Tab.2 The bacterial enzyme activity before and after UV mutagenesis/IU·m L-1

2.4 酶活穩定性(表3)

從表3可以看出,E140的紫外誘變菌株E140′的酶活最高,比較穩定,且最高酶活為0.90 IU·m L-1,較出發菌株E140的0.68 IU·m L-1提高了32.35%。

表3 6株誘變菌株的酶活穩定性/IU·m L-1Tab.3 Enzyme activity stability of the six mutation strains/IU·m L-1

2.5 討論

剛果紅脫色圈的直徑大小并不能直接反映細菌纖維素酶活力的高低。當細菌產纖維素酶但不分泌到培養基時(即產生的酶附著在細菌的表面,這種情況比較少),就很難觀察到脫色圈。另外,脫色圈的大小一定程度上與酶的擴散程度相關,受時間影響很大。因此,實驗僅以有無脫色圈作為是否有纖維素酶活性的判斷標準(目的在于篩選去掉沒有纖維素酶活性的其它菌株),而以DNS法測得的酶活作為酶活高低的判斷標準。實驗發現,脫色圈直徑的大小、脫色圈直徑與菌落直徑的比值,與DNS法測得的酶酶活性高低并不一致(表1),也說明僅用脫色圈直徑的大小、脫色圈直徑與菌落直徑的比值作為纖維素酶活性的評價方法并不可靠。建議,在篩選規模較大的時候,以簡單的方法(如剛果紅脫色圈法)進行初篩、以復雜但精確的方法(如DNS法)進行復篩,兼顧篩選的效率并進一步擴大篩選范圍,以快速獲得更多、更高效的產酶菌株。

3 結論

通過剛果紅脫色圈法初篩及DNS法復篩,得到6株纖維素酶酶活最高的細菌,再經紫外誘變處理,獲得了酶活提高32.35%的誘變菌株E140′。表明采用剛果紅脫色圈法和DNS法聯合篩選并結合紫外誘變,可以獲得纖維素酶酶活高的細菌。

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Screening and Ultraviolet Mutagenesis of Cellulase-Producing Bacteria

ZHANG Xue-jia1,2,TIAN Yun1,2,LU Xiang-yang1,2
(1.College of Bioscience and Biotechnology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 2.Hunan Agricultural Bioengineering Research Institute,Changsha 410128,China)

Firstly,143 strains with cellulase activity were obtained by primary screening with Congo red decolorizing ring method,and then 6 strains with the highest enzyme activity were obtained by screening with DNS method.After the furtherly UV mutagenesis treatment,a mutant strain E140′with the highest enzyme activity increasing and genetic stability was got,whose enzyme activity reached 0.90 IU·m L-1,increasing by 32.35%than that of the starting strain(0.68 IU·m L-1).It showed that cellulase-producing bacteria with high enzyme activity could be obtained by screening with both Congo red decolorizing ring method and DNS method, combining with UV mutagenesis treatment.

Congo red;DNS;UV mutagenesis;cellulase

TQ 920.1 Q 936

A

1672-5425(2013)03-0014-03

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.03.004

科技部國際科技合作項目(2010DFA62510),教育部2009年度長江學者和創新團隊發展計劃項目(IRT0963)

2012-12-20

張學佳(1986-),男,湖南益陽人,碩士研究生,主要從事應用微生物學研究,E-mail:zhangxuejia99@163.com;通訊作者:盧向陽,教授,E-mail:xiangyangcn@163.com;田云,副研究員,E-mail:tianyun79616@163.com。