解纖維梭菌纖維小體的研究進展

趙 飛,辛 盛,盧向陽,田 云

(1.湖南農業大學生物科學技術學院,湖南長沙410128;2.湖南省農業生物工程研究所,湖南長沙410128)

解纖維梭菌纖維小體的研究進展

趙 飛1,2,辛 盛1,2,盧向陽1,2,田 云1,2

(1.湖南農業大學生物科學技術學院,湖南長沙410128;2.湖南省農業生物工程研究所,湖南長沙410128)

解纖維梭菌(Clostridium cellulolyticum)是一種非反芻類中溫兼性厭氧細菌,能夠分泌纖維小體多酶復合物,對結晶纖維素具有高效的降解能力。纖維小體均含有最多可以結合8個酶分子的腳手架蛋白CipC,CipC的N端是由碳水化合物結合模塊、8個高度同源的粘連模塊和2個親水性的X2模塊組成。纖維小體復合物的所有酶組分都含有一個特殊的對接蛋白模塊,能夠特異性地與CipC粘連蛋白相結合。編碼CipC蛋白以及9個與纖維素降解相關酶類的基因都在一個高達26 kb的大基因簇上。近年來,解纖維梭菌纖維小體的相關研究不斷深入,已成功設計、構建人工纖維小體,并且成功在釀酒酵母中轉入、表達纖維小體。通過對現有工程菌株的代謝網絡改造,可以提高生物煉制的產率、降低生產成本。

解纖維梭菌;纖維小體;腳手架蛋白;纖維素酶

隨著化石能源——石油、煤炭、天然氣等的不斷消耗枯竭,迫切需要發展新型綠色可再生能源來支撐人類社會的可持續發展。纖維素資源是地球上最豐富的可再生資源,但絕大多數纖維素以焚燒或堆積形式被處理掉,不僅造成資源的浪費,還對環境產生極大的污染。利用微生物發酵實現纖維素向化工原料和燃料的轉化,是解決纖維素堆積問題與化石能源枯竭問題的重要方式。纖維素分子是由β-D-吡喃葡萄糖(β-D-Glcp)單元通過β-1,4-糖苷鍵聚合在一起形成的均一直鏈聚糖,纖維素分子聚集在一起形成纖維絲,這種物質非常致密且高度有序,致使纖維素中的多數β-1,4-糖苷鍵不易與酶接觸,難以降解。在無氧的環境中,細菌是纖維素的主要降解者,其中梭菌作用顯著[1],因此人們從室溫及高熱環境中分離到了大量的梭菌菌株,解纖維梭菌(Clostridium cellulolyticum)便是其中之一[2]。

解纖維梭菌是一種非反芻類中溫兼性厭氧細菌,于1992年首次從腐爛草堆中分離得到[3],其分泌產生的多酶復合體系——纖維小體,是一種可以有效降解植物細胞壁成分的復雜胞外酶系,由沒有催化活性的腳手架蛋白(Scaffoldin)以及多種可以降解纖維素、半纖維素和果膠質的纖維小體糖苷水解酶組成[4]。解纖維梭菌纖維小體在生物質降解過程中起著十分重要的作用,是符合統合生物加工過程(Consolidated bioprocessing,CBP)要求的最有希望的典型厭氧纖維素降解菌之一[5]。近年來的研究熱點集中在揭示纖維小體的組成、酶組分的協同作用、結構特征、纖維素的降解機制以及天然生境中纖維小體的多樣性,并通過基因工程手段對纖維小體進行基因突變與人工改造。這些研究有助于更深入了解纖維小體的功能及其降解纖維素的作用機制,以便設計出更高效的纖維素降解活性組分。

1 纖維小體概況

纖維小體復合體由結構蛋白模塊和催化模塊兩類組分組成,結構蛋白模塊包括纖維小體中關鍵的非催化亞基——腳手架蛋白,其上含有多個粘連模塊(Cohesin),這些粘連模塊通過與催化蛋白上的對接模塊(Dockerin)特異性地結合,將各種催化蛋白穩定在復合體的超分子結構中。催化模塊包括降解植物細胞壁所必需的各種纖維素酶、半纖維素酶及果膠酶等。此外,腳手架蛋白和部分酶蛋白中還含有能與纖維素特異性結合的碳水化合物結合模塊(Carbohydrate-binding module,CBM),其對底物具有定向效應。不同厭氧微生物的纖維小體中腳手架蛋白上的粘連模塊(表 1)、催化蛋白上的對接模塊及碳水化合物結合模塊的類型及數目均不同[6]。

表1 不同厭氧細菌的腳手架蛋白結構Tab.1 Scaffoldin structure of different anaerobic bacteria

2 解纖維梭菌纖維小體

解纖維梭菌纖維小體是由糖基化無催化活性的腳手架蛋白Cip C[4]、解纖維梭菌編碼的對應纖維素酶通過粘連蛋白與對接蛋白相互作用而形成的。通過對基因上游約3 kb測序分析顯示,“cel”基因簇的cipC基因是該基因簇的第1個基因,這個基因簇編碼了多種屬于不同糖苷水解酶(GH)的水解酶類,除“cel”基因簇之外,還發現了3個編碼纖維小體蛋白的基因(cel5A、cel5D、cel44O)[14]。已知解纖維梭菌纖維小體基因的遺傳編碼結構如圖1所示。

圖1 解纖維梭菌纖維小體基因的遺傳編碼結構Fig.1 The hereditary coding structure of cellulosome gene from Clostridium cellulolyticum

圖1中cel 48F、cel8C、cel9G、cel9E、cel 9H、cel9J、cel 9M、cel 5N、cel 5A、cel 5D為纖維素酶基因,man5K為半纖維素酶基因,rgl11Y為果膠酶基因,cipC為腳手架基因,cel 44O、cel 5I為其它粘附蛋白基因,orfX為未知蛋白功能基因[14]。

2.1 解纖維梭菌纖維小體的腳手架蛋白

“cel”編碼的腳手架蛋白Cip C的組織排列與噬纖維梭菌(Clostridium cellulovorans)的腳手架蛋白相似。其大小為160 000,由一系列橢圓形模塊像珍珠項鏈一樣連接而成。其N端有1個CBM3a模塊,后面接著1個未知功能的X2模塊和7個疏水的粘連蛋白模塊[15]。其C端含有第2個未知功能的X2模塊,其后是第8個粘連蛋白模塊,但不含任何對接蛋白模塊,該模塊有可能參與錨定于細胞表面的過程,類似于熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)纖維小體的腳手架蛋白Cip A[16]。已知解纖維梭菌纖維小體中復合體組裝模式如圖2所示。

圖2 解纖維梭菌纖維小體中復合體組裝模式Fig.2 The construction mode of the complex in Clostridium cellulolyticum cellulosome

分析CipC中的3類蛋白模塊發現,CipC中的CBM3a含有160個氨基酸,這與熱纖梭菌纖維小體腳手架蛋白的CBM3a很相似。結構分析顯示,其含有鈣離子結合位點,由9條鏈組成果凍卷的拓撲結構,推測其它面為纖維素結合面,在其頂端有1條未知功能的小溝。研究表明,2個X2模塊具有親水性,其功能尚不清楚,這些親水的模塊可能起到構象鏈接片段的作用,也可能起到增大腳手架蛋白可溶性的作用,而腳手架蛋白中包含多個疏水的粘連蛋白;Doi等[17]發現X2模塊可能參與纖維小體結合到細胞表面的過程,結合實驗顯示,X2模塊可能含有親水結構域(HLD),該結構域可能具有對細胞表面和纖維素的雙重親和性功能[18]。纖維小體復合物的組裝依靠酶分子相連的對接蛋白與腳手架上的粘連蛋白的特定相互作用,但不同酶組分并未嚴格限定只能與某種特定的粘連蛋白作用[16]。研究發現,解纖維梭菌還編碼其N末端具有GH5催化結構域的蛋白Cel5I,這個催化結構域連接2個CBM3a模塊以及3個C末端表層同源結構域(S-Layer homology module,SLH),Cel5I缺少對接蛋白結構域,說明該蛋白與細胞壁結合,而不是與CipC蛋白結合。

2.2 解纖維梭菌纖維小體中的主要酶組分

解纖維梭菌與纖維素降解相關的基因大部分位于一個約26 kb的大基因簇(“cel”簇)中。該基因簇編碼了多種屬于不同糖苷水解酶家族(GH)的水解酶類(圖1):8個纖維素酶基因、1個甘露聚糖酶基因及1個鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶基因。此外,還發現了3個編碼纖維小體蛋白的基因cel5A、cel5D、cel44O。

解纖維梭菌纖維小體中纖維素酶和其它纖維素降解系統相關的酶類都是多結構域蛋白組分。這些結構域中部分是結構和功能獨立模塊,部分是1個或2個結構域連接起來行使功能。對接蛋白模塊是纖維小體酶類的共同模塊,Pagès等[8]證明對接蛋白模塊與纖維小體的形成有關,它將纖維素酶錨定于腳手架蛋白Cip C上。在解纖維梭菌纖維小體中,僅Man5K和Cel44O兩個蛋白在其C端發現相應的對接蛋白, Cel48F、Cel8C、Cel5N、Cel5A和Man5K都具有2個結構域:1個由糖苷水解酶結構域組成的催化模塊和1個對接蛋白模塊。許多纖維小體酶類包含1個或2個與糖苷水解酶結構域連接的其它結構域組分,這些組分大部分歸類到碳水化合物結合模塊(CBM)家族中(圖3)。

圖3 解纖維梭菌纖維小體水解酶類結構域Fig.3 The structure domain of the hydrolases in Clostridium cellulolyticum cellulosome

以下纖維素酶已得到表達、純化與表征:Cel48F、Cel48C、Cel5A、Cel5D、Cel9G(作為Cel9G、Cel9H和Cel9J的代表)、Cel9E和Cel9M,它們對不同底物的催化活性不同。Cel44O和Cel5N尚未被研究,但Cel44O與熱纖梭菌Cel44J的C端非常相似,Cel44J是具有部分木聚糖降解能力的纖維素酶[19],因此推測Cel44O可能也是一種纖維素酶。Cel48F是解纖維梭菌纖維小體的主要組分,只含有糖苷水解酶第48家族的催化結構域,是一種持續性作用的纖維素內切酶[20]。該酶對非結晶磷酸膨脹纖維素的活性較高,但對羧甲基纖維素(CMC)活性較低,這可能是其催化位點是由2對環肽構成,而CMC的羧甲基取代物不能與被環肽封閉的活性位點很好地結合所導致的[21]。

4種纖維素內切酶Cel48C、Cel5A、Cel5D和Cel9M的底物水解譜(Substrate hydrolysis spectra)相似,對不同的非結晶纖維素、CMC和磷酸膨脹纖維素均表現出較高活性,但是都不能水解β-1,3鍵。Cel5A對纖維二糖的抑制敏感,Cel48C對纖維二糖的抑制不敏感[22],Cel9M水解微結晶纖維素的主要產物是纖維四糖,同時對木聚糖表現出較強的酶活力。

Cel9G是一種特殊的內切纖維素酶,含有糖苷水解酶第9家族(GH9)的催化結構域,該結構域與CBM3c家族的纖維素結合域通過18-氨基酸殘基連接肽連在一起[23],兩者之間形成多個氫鍵,這使得兩個結構域的位置相對穩定。GH9催化結構域單獨存在時沒有催化活性,必須連接到CBD上才能發揮功能,作用于微結晶纖維素[24]。Cel9G可有效水解CMC,在所有已表征的解纖維梭菌纖維小體的纖維素酶中, Cel9G對微結晶纖維素的活性最高。因此推測,當纖維小體與微結晶纖維素結合后,Cel9G參與纖維素高級結構的破壞,然后釋放出單鏈進行內切水解。

Cel9E對p NP-纖維二糖苷的活性很高,其降解微結晶纖維素的產物幾乎全是纖維二糖,因此Cel9E是一種纖維二糖水解酶[25]。Man5K和Rgl11Y是兩種非纖維素酶,由位于“cel”簇第二部分的基因編碼。Rgl11Y是一種內切型鼠李糖醛酸聚糖裂解酶, Man5K是一種內切甘露聚糖酶,作用于半乳甘露聚糖中乳糖側鏈替換度較低的主鏈。這些酶因帶有對接蛋白,從而被組合進了纖維小體[26]。

酶學和結構學研究表明,解纖維梭菌纖維小體中存在多種纖維素酶,其中Cel48F和Cel9G是持續性作用的酶組分,也是纖維小體的主要催化組分,這兩種酶的催化特征明顯不同,其降解纖維素方式也不同。需要注意的是,所有酶組分對結晶纖維素的催化活性都較低,但纖維小體對結晶纖維素卻有較高催化效率,表明不同酶組分之間的相互協調作用于對高效降解纖維素十分重要。

3 展望

解纖維梭菌吸附于纖維素上是纖維素降解的第一步,當菌體進入不溶性纖維素后,便開始利用結晶纖維素生長。在不溶性底物上可檢測到粘附著的大量菌體,這可能是由細胞粘連的纖維小體或細胞連接的纖維素酶介導的。在營養豐富的培養基中,解纖維梭菌只能代謝少量的可溶性碳水化合物[27]。與在纖維二糖上生長不一樣,解纖維梭菌在纖維素上生長時,菌體必須先粘附于底物上,再將其水解形成可溶性糖。細菌的生長受到可溶性底物的限制,纖維素上所釋放的可溶性糖是菌體生長所需的底物,一旦生成就會被細菌快速吸收[28],從而減輕產物對酶的抑制作用。連續培養實驗發現,纖維二糖的主要代謝產物是乙酸,其次才是乙醇和乳酸。當乙醇和乳酸等還原性化合物達到飽和、生物質不能再次氧化EMP途徑中生成的所有NADH時,NADH通過NADH-鐵氧還蛋白-還原酶和氫化酶途徑,以較慢速率再生為NAD+。在纖維二糖充足的條件下,NADH-鐵氧還蛋白-還原酶和氫化酶的活性是維持氧化還原平衡的關鍵,其碳流主要是通過排出胞外多糖、胞外蛋白、氨基酸及丙酮酸等溢流而達到平衡。

解纖維梭菌屬于中溫兼性厭氧細菌,因其高效降解結晶纖維素受到高度重視。迄今為止,對于解纖維梭菌的研究中,已經發現其30個編碼纖維小體催化亞基的基因,且對其第一個纖維素降解的負突變菌株Cip C Mutl的分子研究發現,解纖維梭菌中至少能夠合成22個含有對接蛋白的組分。因此,利用現代分子生物學技術克隆調節基因以及結構基因變得簡單可行,這為新的研究提供了無限的空間。通過結構基因及調節基因的表達,便可以工程化地改變解纖維梭菌纖維小體的組分,從而利用基因工程設計出功能特定的纖維小體,以提升對復雜多糖的降解效率。纖維素直接轉化為工業原料的新型工藝要求對非纖維素降解菌的基因進行改造,使其能夠在纖維素降解的相關酶系中轉入和表達,從而擁有降解纖維素的功能。

統合生物加工過程(CBP)的工藝要求將纖維素酶和半纖維素酶的生產、水解和發酵組合在一起完成。因此,將編碼纖維小體的基因轉入釀酒酵母中成為解決這一問題的有效途徑[29,30]。目前,研究者已將熱纖梭菌腳手架蛋白Cip A的第3粘連蛋白與解纖維梭菌的微型CipC1的C末端融合,形成雜合的微型腳手架蛋白Scaf3,并成功轉入產溶劑的梭菌形成產物,這對直接轉化纖維素為可溶性化工產品具有重大意義。

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Research Development in Cellulosome from Clostridium Cellulolyticum

ZHAO Fei1,2,XIN Sheng1,2,LU Xiang-yang1,2,TIAN Yun1,2
(1.College of Bioscience and Biotechnology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 2.Hunan Agricultural Bioengineering Research Institute,Changsha 410128,China)

Clostridium cellulolyticum is a kind of medium-temperature-facultative anaerobic bacteria in nonruminant that can degrade crystalline cellulose effectively by secreting cellulosome multienzyme complex.Cellulosome contains the scaffoldin CipC which can mostly combine eight enzyme molecules.The N-end of Cip C consists of carbohydrate-binding module(CBM),eight highly homologous cohesins and two hydrophilic X2 modules.The all enzyme components of the cellulosome complex possess a special docking protein module that can bind specifically with the Cip C cohesin.The genes coding Cip C protein and nine cellulose-degradation-related enzyme are all in a big gene cluster up to 26 kb.In recent years,the researches of cellulosome from Clostridium cellulolyticum are deepening.Artificial cellulosome has been successfully designed,constructed,turned in and expressed in Saccharomyces cerevisiae.By reforming metabolic networks of the existing engineering strains,the bio-refinery yield can be improved as well as the cost reduced.

Clostridium cellulolyticum;cellulosome;scaffoldin;cellulase

Q 936

A

1672-5425(2013)03-0001-05

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.03.001

科技部國際科技合作項目(2010DFA62510),教育部2009年度長江學者和創新團隊發展計劃項目(IRT0963)

2012-11-30

趙飛(1986-),男,湖南郴州人,碩士研究生,主要從事應用微生物學研究,E-mail:zfwx100@163.com;通訊作者:盧向陽,教授,E-mail:xiangyangcn@163.com;田云,副研究員,E-mail:tianyun79616@163.com。