高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定配合飼料中氯霉素殘留量的研究

魏云計(jì)，馮 民

（淮安出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 淮安 223001）

因?qū)Ω锾m氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌具有很強(qiáng)的活性，氯霉素表現(xiàn)出廣譜的抗菌能力，廣泛地應(yīng)用于動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)。由于其能導(dǎo)致人體產(chǎn)生再生障礙性貧血和溶血性貧血等毒副作用，歐盟、美國(guó)等先后將其定為禁用藥物，不得用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)中，雖然其在動(dòng)物體內(nèi)殘留量低，但毒副作用依然存在[1]。飼料一般是獸藥添加的主要載體，開(kāi)展飼料中氯霉素檢測(cè)是從源頭進(jìn)行獸藥殘留控制的有效方法，因此研究配合飼料中氯霉素檢測(cè)方法具有重要意義。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于組織中氯霉素的殘留檢測(cè)方法已很成熟，主要采用酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-質(zhì)譜法等[2-18]。由于飼料的品種較多，組成復(fù)雜，使用普通的檢測(cè)儀器測(cè)定其藥物殘留基質(zhì)干擾較大，本研究利用液相色譜-質(zhì)譜法的強(qiáng)選擇性和抗干擾能力特點(diǎn)，建立了飼料中氯霉素殘留的快速定性定量方法，定量限為0.3 μg·kg-1遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于GB/T 21108-2007 規(guī)定的限量，對(duì)配合飼料生產(chǎn)和畜牧養(yǎng)殖具有指導(dǎo)意義。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Thermo Finngan TSQ Quantum Ultra ENR 串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）；C18 柱（150mm×3.1 mm i.d.,3.5 μm,Agilent）。

甲醇為色譜純，乙酸乙酯、正己烷、氯化鈉均為分析純，水為去離子水。氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司，純度≥98%，氘代氯霉素（chloramphenicol-D5）購(gòu)自WITEGA Laboratorien Beelin-Adlershof GmbH公司，用甲醇溶解并配制成1.0 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再根據(jù)需要稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃避光保存。

1.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取飼料2.00±0.05 g于50 mL 具塞離心管中，加入水4 mL，于渦旋混合器上混勻30 s 后靜置10 min待飼料浸潤(rùn)，加入氨化乙酸乙酯（乙酸乙酯/25%氨水，v/v，98∶2）10 mL，于渦旋混合器上快速混勻30 s，超聲波提取10 min；8000 rpm離心3 min，取上層有機(jī)溶液至50 mL梨形瓶中；向殘?jiān)屑尤氚被宜嵋阴? mL，進(jìn)行二次提取，方法同上，合并兩次上層清液于45℃水浴中減壓濃縮至干，用甲醇/水（v/v，2∶8）1 mL 溶解殘留物，加入正己烷1 mL 凈化脫脂，離心后取下層，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，濾液供液相色譜-質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3 液質(zhì)聯(lián)用儀分析條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（150 mm×2.1 mm i.d.,3.5 μm）；進(jìn)樣量為25 μL；柱溫為30℃；流動(dòng)相為A去離子水、B甲醇；梯度洗脫條件為0～4 min A 70%；4.1～6.5 min A 20%；6.6～8.5 min A 70%；流速為250 μL·min-1。

1.3.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子掃描，噴霧電壓2500V，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）方式檢測(cè)，優(yōu)化質(zhì)譜條件見(jiàn)附表。

附表 氯霉素優(yōu)化的質(zhì)譜條件

1.4 線性范圍、檢出限和定量限

配制6個(gè)不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，溶液中氯霉素為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng · mL-1，氘代氯霉素-D5 的質(zhì)量濃度為5.0 ng·mL-1，測(cè)定峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積的比值（氯霉素峰面積/氘代氯霉素-D5 面積）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在空白配合飼料基質(zhì)中添加氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，以信噪比（S/N）≥3時(shí)的含量定為方法的檢出限（LOD）；以信噪比（S/N）≥10 時(shí)的含量定為方法的定量限（LOQ）。

1.5 回收率的測(cè)定

選取陰性配合飼料樣品，添加氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)，氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品添加水平為0.3、1.0、5.0 μg·kg-1，氘代氯霉素-D55.0 μg·kg-1，每個(gè)添加水平5次平行。

2 試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)30個(gè)配合飼料樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有12個(gè)樣品氯霉素殘留量＞0.3 μg·kg-1，其藥物殘留量均低于國(guó)家殘留監(jiān)控的限量要求，按照本方法的定量限計(jì)算陽(yáng)性率為40.0%。

2.1 線性范圍、檢出限和定量限

飼料中添加氯霉素0.3 μg·kg-1、氘代氯霉素-D55.0 ng·mL-1標(biāo)準(zhǔn)品MRM色譜圖見(jiàn)圖1，標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM 色譜圖見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，氫霉素的回歸方程為Y=0.0426245+0.0142396X，相關(guān)系數(shù)為0.9939，檢出限為1，定量限為0.3。

圖1 飼料中添加氯霉素0.3 μg·kg-1、氘代氯霉素-D55.0 ng·mL-1標(biāo)準(zhǔn)品MRM色譜圖

圖2 氯霉素、氘代氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖

2.2 回收率和精密度

結(jié)果表明，回收率平均在89.7%～105.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）低于8.7%。

3 討 論

3.1 提取條件的優(yōu)化

氯霉素屬于弱極性物質(zhì)，易溶于甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，可以通過(guò)這些溶劑提取。乙酸乙酯對(duì)氯霉素的提取效率最高，適合于動(dòng)物組織樣品的提取。由于配合飼料含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)、纖維素、礦物質(zhì)等復(fù)合組分，本研究比較了上述幾種溶劑及堿化乙酸乙酯提取效率，結(jié)果表明，堿化乙酸乙酯提取效率優(yōu)于其他幾種常見(jiàn)試劑，試驗(yàn)對(duì)堿化乙酸乙酯的濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，當(dāng)乙酸乙酯/25%氨水（v/v，98∶2）時(shí)提取效率及穩(wěn)定性最好，隨著氨水比例提高，提取效率沒(méi)有提高，反而對(duì)提取的基質(zhì)干擾越大；同時(shí)飼料樣品的水分很少，在提取前充分潤(rùn)濕有利于目標(biāo)物的提取，提高回收率。

3.2 樣品的凈化

堿化乙酸乙酯提取效率雖高，但提取的非極性脂溶物較多，基質(zhì)干擾較大，需要進(jìn)一步凈化。GB/T 21108-2007和文獻(xiàn)報(bào)道的凈化方法用甲醇和氯化鈉4%溶液溶解目標(biāo)物，正己烷凈化脫脂兩次，乙酸乙酯進(jìn)行液-液分配萃取凈化，再過(guò)SPE 固相萃取柱凈化。本研究結(jié)果表明，在甲醇/水（v/v 2∶8）1 mL溶解殘留物后用正己烷1 mL凈化脫脂，可以有效的去除基質(zhì)干擾，省去固相萃取過(guò)程，縮短樣品前處理時(shí)間。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)建立了配合飼料中氯霉素測(cè)定的高效液相色譜-質(zhì)譜法。串聯(lián)質(zhì)譜和同位素內(nèi)標(biāo)的使用消除了配合飼料復(fù)雜基質(zhì)的影響，提高定量的準(zhǔn)確性。該方法操作簡(jiǎn)便，省去固相萃取步驟，縮短檢測(cè)周期，靈敏度較高，回收率較好。

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