鼻咽癌患者樹突狀細胞體外誘導的初步研究

覃揚達 司勇鋒* 蘭桂萍 周向陽 杜海軍 周 玲 曾 毅

（1 廣西壯族自治區人民醫院，廣西 南寧530021；2 中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所，北京102206）

鼻咽癌患者樹突狀細胞體外誘導的初步研究

覃揚達1司勇鋒1* 蘭桂萍1周向陽1杜海軍2周 玲2曾 毅2

（1 廣西壯族自治區人民醫院，廣西 南寧530021；2 中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所，北京102206）

目的 探討不同進展階段鼻咽癌患者的樹突狀細胞體外誘導效果。為臨床免疫治療提供的成熟樹突狀細胞。方法本研究選取臨床不同分期鼻咽癌患者的外周血分離單核淋巴細胞，體外誘導培養。通過光學顯微鏡和流式細胞儀檢測樹突狀細胞的體外誘導效果。結果體外誘導獲得的樹突狀細胞具有典型的形態，其細胞表面表達CD83、CD86和CD-DR樹突狀細胞的標識分子。結論不同進展階段鼻咽癌患者外周血均可以體外誘導出樹突狀細胞。

鼻咽癌；樹突狀細胞；體外誘導

鼻咽癌（Nasoparyngeal carcinoma，NPC）是中國南方一些省（自治區）的常見惡性腫瘤之一。中晚期鼻咽癌治療后常常復發或向遠處轉移，對此臨床上尚無有效治療方案。樹突狀細胞（Dendritic cell，DC）是人體內分布廣泛、功能最強的抗原提呈細胞（Antigen presenting cells，APC），也是唯一能激活初始型T細胞的APC[1-3]。以樹突狀細胞為基礎的免疫治療，可以提高鼻咽癌患者的特異性細胞免疫水平，在NPC的DC的免疫治療方面取得一些進展[4-6]。皮內免疫DCLMP2可以有效地提升NPC患者的LMP2特異性CTL水平[5]。提高的特異性CTL可能會清除放化療后殘余的NPC細胞，抑制潛在NPC的復發和轉移。本研究取不同進展階段的NPC患者外周血，進行體外樹突狀細胞的誘導培養，觀察不同進展階段鼻咽癌患者的樹突狀細胞體外誘導效果，初步對確定了NPC患者進行DC免疫治療的適用人群。

1 資料與方法

1.1 一般資料

所有患者需經過病理確診為不同進展階段的NPC患者，年齡＜70歲，需放化療后3個月以上，預期生存時間＞3個月。肝、腎、骨髓功能正常。簽署知情同意書，自愿接受DC-LMP2免疫。

1.2 材料DC

接受免疫的NPC分離外周血單核細胞體外誘導獲得。人重組細胞因子rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α購自Peprotech公司。CD83、CD86和CDDR抗體 購于BD公司。CellGro DC培養基購于上海微科生化試劑公司。

1.3 DC誘導與培養

外周血分離自體PBMC，以5×106/孔接種六孔板。置37℃ 5% CO2，飽和濕度的培養箱中培養貼壁2h，輕輕搖晃，棄去懸浮細胞，再緩慢往細胞孔中加入3mL含細胞因子的CellGro DC培養基（rhGMCSF終濃度500U/mL，rhIL-4終濃度500U/mL）。置5%CO2，37℃飽和濕度的培養箱中培養7d。培養至第3天，半量更換CellGro DC培養基。每天光鏡下觀察細胞形態變化。第7天發現的不規則的，具有樹突狀形態的細胞為DC。

1.4 DC檢測

吹打培養7d的DC，收集懸浮DC（250g/min，離心10min）。再在含成熟因子的DC培養基中（含rhGM-CSF 500U/mL、rhIL-4 500 U/mL、TNF-α 400U/mol），繼續培養48h。第9天收集成熟的DCLMP2（250g/min， 離心10min）。以CD83、CD86和DC-DR抗體標記后及染色，用流式細胞儀檢測DC表面特征性分子的表達。

2 結 果

2.1 病例特征

本臨床試驗病例均來源于廣西自治區人民醫院2010年6月至2011年3月。共24名NPC患者自愿參加了本次試驗，女13名，男11名，年齡22～61歲。其中Ⅰ期3名（男2名，女1名），Ⅱ期10名（男4名，女6名），Ⅲ期7名（男3名，女名），Ⅳ期4名（男2名，女2名）。見表1。

表1 DC表面特征性分子的表達

2.2 DC形態鑒定

在光學顯微鏡下，外周血分離的單核細胞經過體外的誘導和培養，細胞開始聚集成團，細胞體積增大，逐步由貼壁轉變為懸浮狀態，表面開始形成褶皺，周圍伸出許多樹突狀，形成不規則分支呈網狀，如圖1。

3 討 論

圖1 誘導后成熟后DC形態（400倍）

樹突狀細胞是1973年美國洛克菲勒大學的Steinman和Cohn[7]教授首先從小鼠的脾臟淋巴細胞分離獲得，由于其表面有許多突起而形成許多褶皺，象伸展的樹枝，故而命名為樹突狀細胞。DC細胞的功能主要是參與機體的特異性免疫應答，包括體液免疫和細胞免疫。作為專職的的抗原提呈細胞，其活動能力是巨噬細胞和B細胞的10～100倍，可激活初始型T細胞[4]。但DC在體內數目極少，不足外周血單核細胞的1%，因而自然分離DC十分困難。目前用于治療和研究的樹突狀細胞，均為體外培養獲得。由于一些腫瘤患者體內的DC又發生功能缺陷。那么是否所有的腫瘤患者的前體細胞都可以誘導出成熟的樹突狀細胞呢？因而我們以鼻咽癌為例，試圖從體外培養的角度探討不同進展階段的NPC患者的外周血是否可以培養成熟的樹突狀細胞。從我們的實驗結果可以看出：在所選的鼻咽癌患者的外周血中均可以誘導培養出具有典型的樹突狀細胞形態。通過流式細胞儀檢測在其表面表達DC特征性的CD83、CD86和DC-DR分子。這為我們對NPC患者DC為基礎的免疫治療對象的篩選提供了依據。誠然，這僅僅是免疫治療中對NPC患者篩選的條件之一，除此之外我們還對患者的年齡、生存期、身體狀況、臨床治療的時間、本人意愿等進行多方面的具備的條件研究后才能最終確定治療方案。臨床治療方案及結果另有文章詳細報導。

[1] Steinman RM.The dendritic cell system and its role in immunogenicity[J].Annu Rev Immunol,1991,9(2):271-296.

[2] Knight SC,Stagg AJ.Antigen-presenting cell types[J].Curr Opin Immunol,1993,5(3):374-382.

[3] Hart DN.Dendritic cells:Unique leukocyte populations which control the primary immune response[J].Blood,1997,90(9):3245-3287.

[4] Lin CL,Lo WF.Immunization with Epstein-Barr Virus peptidepulsed dendritic cells induces functional CD8+T-cell immunity and may lead to tumor regression[J].Cancer Res,2002,62(23):6952-6958.

[5] Zuo JM,Zhou L.Induction of cytotoxic T lymphocyte responses in vivo after immunotherapy with dendritic cells in patients[J].J.Microbiol Immunol,2006,4(1):41-48.

[6] Pan Y,Zhang J.In vitro anti-tumor immune response induced by dendritic cells transfected with EBV-LMP2 recombinant adenovirus [J].Biochem Biophys Res Commun,2006,347(3):551-557.

[7] Steinman RM,Cohn ZA.Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice I Morphology quantitation tissue distribution[J].J Exp Med,1973,137(5):1142-1162.

A Preliminary Study on the Induction of Dendritic Cells in Patients with Nasopharyngeal Carcinoma in Vitro

(QIN Yang-da1, SI Yong-feng1*, LAN Gui-ping1, ZHOU Xiang-yang1, DU Hai-jun2, ZHOU Ling2, ZENG Yi2

1 People's Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China；
2 National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing100052, China)

ObjectiveExplore the effects of dendritic cells (DCs) induced in vitro in different stages of patients with nasopharyngeal carcinoma and offer the mature dendritic cells for clinical immuno-therapy. Methods Peripheral blood mononuclear lymphocytes were isolated from different stages of patients with nasopharyngeal carcinoma and induced into DCs in vitro. The morphology and molecular characteristics of DCs were detected by microscope and flow cytometry respectively.ResultsDCs with typical morphology were displayed after induction in vitro. Molecular of CD83CD86and CD-DR was detected on the surface of DCs.ConclusionDCs could be induced in vitro from different stages of patients with nasopharyngeal carcinoma.

R739.6

B

1671-8194（2013）18-0003-02

廣西壯族自治區衛生廳科研項目（編號：重2010038）