糖尿病腎病大鼠ET-1、IL-1β的表達及多種銀杏葉提取物的干預作用比較

馬文祥 沈建飛 盛一梁

（蘇州太倉市中醫醫院藥劑科，蘇州 太倉 215400）

糖尿病腎病大鼠ET-1、IL-1β的表達及多種銀杏葉提取物的干預作用比較

馬文祥 沈建飛 盛一梁

（蘇州太倉市中醫醫院藥劑科，蘇州 太倉 215400）

目的 探討糖尿病腎病大鼠中ET-1、IL-1β細胞因子表達情況，多種銀杏葉提取物對其表達的影響。方法 120只健康雄性Wistar大鼠隨機分為正常組、假手術組、糖尿病腎病組、舒血寧注射液組、銀杏達莫注射液組、金納多注射液組，建立糖尿病腎病模型，嚴格按照試劑盒上的操作方法，測定各組大鼠ET-1、IL-1β含量。結果 與正常組比較，糖尿病腎病組血清、尿液、腎臟組織中ET-1和血清IL-1β的含量升高（P＜0.05）；與糖尿病腎病組比較，三種銀杏葉提取物注射液均能顯著降低ET-1、IL-1β含量（P＜0.05），尤其是金納多注射液能顯著降低尿液、腎臟組織中ET-1和血清IL-1β（P＜0.01）。糖尿病腎病組血清中ET-1、IL-1β均分別呈正相關（r=0.79、0.83，P＜0.05）。結論 糖尿病腎病大鼠ET-1、IL-1β細胞因子的表達明顯升高，且二者血清中的表達具有正相關；銀杏葉提取物注射液中金納多注射液干預后，與糖尿病腎病組比較，ET-1、IL-1β細胞因子表達下調最為明顯，但各銀杏葉提取物組間比較，無顯著性差異（P＞0.05）。

糖尿病腎病；ET-1；IL-1β；相關性；舒血寧注射液；銀杏達莫注射液；金納多注射液

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病主要的微血管并發癥之一，嚴重影響糖尿病患者的預后和生存，一旦出現腎小球基底膜（GBM）增厚和以系膜區為主的細胞外基質（ECM）增生等病理變化，往往難于逆轉，是糖尿病致殘致死的重要原因。發病機制不清楚，認為與細胞因子參與發病有關，ET-1、IL-1β在NS的發病中起重要作用。本實驗通過觀察不同銀杏葉提取物對DN早期ET-1、IL-1β表達的影響，初步探討銀杏葉提取物對DN發生、發展的作用以及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康雄性wistar大鼠，體質量200～250g，120只（蘇州大學動物飼養中心提供）。鏈脲佐菌素（STZ）（北京博愛港商貿有限公司）。舒血寧注射液，北京雙鶴天然藥物有限責任公司，批號：1301030101，5mL/支，折合銀杏葉提取物為17.5mg（含總黃酮醇苷4.2mg；銀杏內酯0.70mg）。銀杏達莫注射液，湖北民康制藥有限公司，批號：20130305，5mL/支，含銀杏總黃酮4.5～5.5mg、雙嘧達莫1.8～2.2mg。金納多注射液，德國威瑪舒培博士大藥廠，批號458643-1，5mL/支，折合銀杏葉提取物17.5mg，（含銀杏黃酮苷4.2mg）。IL-1β放射免疫分析藥盒均購自北京北方生物技術研究所。ET-1放射免疫試劑盒（中國人民解放軍東亞放免所）。

1.2 DN模型與分組

120只大鼠禁食12h，隨機分出，20只為正常對照組。20只為假手術組（n=20，麻醉后從右背部入口分離右腎，并不作任何處理，作關閉切口，常規飼料，生理鹽水灌胃），大鼠按體質量，腹腔注射65mg/kg枸櫞酸緩沖液（0.1mmol/L）。

其余組別按Wistar大鼠體質量，大鼠腹腔注射氯氨酮70mg/kg麻醉后行右腎切除術1周后，予高糖高脂飲食（常規飼料加20%蔗糖、10%豬油、2.5%膽固醇），4周后（即實驗開始后第5周末），鏈脲佐菌素臨用前用0.1mmol/L枸櫞酸緩沖液配成1%濃度（pH值=4.0）。給予鏈脲佐菌素（STZ）65mg/kg左下腹腔一次性注射。72h后取尾血測非空腹血糖，以血糖≥16.7mmol/L者確立為糖尿病大鼠模型，連續監測血糖、尿糖3d，持續血糖＞16.6mmol/L，尿糖定性+++～++++確定為糖尿病形成，建模失敗者剔除。

實驗大鼠分為正常對照組、假手術組、DN組、舒血寧注射液組、銀杏達莫注射液組、金納多注射液組各20只（n=20，每10只一組，為早、晚期對照）。所有大鼠常規飼養，不限制飲水，不使用胰島素。

表1 第2周末ET-1與IL-1β含量變化（）

表1 第2周末ET-1與IL-1β含量變化（）

組別n ET-1IL-1β血清(ng/L)尿液(ng/24h)腎臟(ng/g)血清(ng/mL)正常組1070.89±6.711.19±0.17146.06±9.550.07±0.91假手術組1080.13±4.111.32±0.75151.12±6.330.06±0.32 DN組10144.11±8.83*△5.67±0.37*△225.69±7.63*△0.51±0.31*△舒血寧注射液組10112.47±6.38*△◇3.21±0.27*△◇174.02±9.21*◇0.15±0.44◇銀杏達莫注射組10125.13±5.83*△◇2.15±0.36*△◇166.74±8.57◇0.17±0.73◇金納多注射液組10103.69±6.39*◇0.58±0.47◇◇153.75±7.85◇◇0.16±0.99◇◇

表2 第8周末ET-1與IL-1β含量變化（）

表2 第8周末ET-1與IL-1β含量變化（）

組別n ET-1IL-1β血清(ng/L)尿液(ng/24h)腎臟(ng/g)血清(ng/mL)正常組1075.15±6.651.23±0.23143.15±6.840.08±0.25假手術組1085.34±5.731.47±1.51167.93±5.730.07±0.83 DN組10169.33±12.67*△6.95±0.58*△246.52±10.36*△0.65±0.13*△舒血寧注射液組10134.15±10.65*△◇3.78±0.49*△◇187.39±11.72*◇0.11±0.08◇銀杏達莫注射組10147.98±11.36*△4.38±1.73*△162.83±15.38◇0.44±0.37*△金納多注射液組10114.13±8.99*◇2.16±0.58◇◇157.82±12.03◇◇0.11±0.67◇◇

1.3 方法

1.3.1 給藥方法

根據糖尿病大鼠飲水量為正常大鼠的2.5倍，舒血寧注射液組、銀杏達莫注射液組、金納多注射液組三組分別于第1天和4周后腹腔注射舒血寧注射液、銀杏達莫注射液、金納多注射液，按體質量稱重，劑量為4mg/（kg·d）。其余三組于第1天和4周后分別腹腔注射生理鹽水4mg/（kg·d）。

1.3.2 觀察指標

第2、8周末，禁食8h后，稱重、麻醉，無菌操作，動物麻醉稱重，股動脈放血，離心后血清-80℃保存，分離提取血清，ET-1與IL-1β含量按相應的放免試劑盒說明操作；收集各組大鼠24h尿液，離心，去沉淀，-20℃保存，ET-1含量按相應的放免試劑盒說明操作。

大鼠取完血后，斷頭處死，取腎組織，稱取200mg，剪碎，加入0.15mol/L乙酸，水浴煮沸后在冰浴下用電子恒速組織勻漿器研磨勻漿，3000r/min，離心15min，離心后取上清液，-70℃保存ET-1含量按相應的放免試劑盒說明操作。

1.3.3 統計學處理

2 結 果

2.1 第2周末ET-1與IL-1β含量變化，見表1。

與正常組比較*P＜0.05；與假手術組比較△P＜0.05；與DN組比較◇P＜0.05，◇◇P＜0.01

2.2 第8周末ET-1與IL-1β含量變化，見表2。

與正常組比較*P＜0.05；與假手術組比較△P＜0.05；與DN組比較◇P＜0.05，◇◇P＜0.01

2.3 第2、8周末DN組血清中ET-1與IL-1β的相關性考察

第2周與第8周末，DN組血清中ET-1、IL-1β均呈正相關（r=0.79、0.83，P＜0.05）；隨著DA組血清中ET-1含量的增高，IL-1β含量升高。

3 討 論

有人認為DN是腎臟的微血管病變，早期表現為腎小球高濾過狀態，繼之出現微量白蛋白尿，尿中白蛋白量逐漸增高進入臨床腎病期，最后發展為終末期腎病。其中腎臟血流動力學改變是微血管病變根本因素，加速基底膜增厚。當基底膜增厚嚴重時，受累的微細血管可部分或全部阻塞，引起組織缺氧，損傷，形成炎癥，以致病變持續加重。目前關于ET-1和DN之間關系研究絕大部分限于實驗室研究階段。ET-1是日本學者1988年從豬動脈內皮細胞培養液中分離出來的一種小分子生物活性肽[1]，主要由血管內皮細胞合成釋放的血管活性多肽，是目前已知體內作用時間最持久的縮血管物質。ET在腎臟疾病中的作用，除了引起血液動力學紊亂、水鹽代謝失調等之外，ET還是一種強大的促纖維化因子，是一種強大的炎癥介質。糖尿病患者長期高血糖狀態能加速和大量形成晚期糖化終末產物，糖化終末產物能刺激單核-巨噬細胞表達和釋放IL-1β。DN時腎小球IL-1β含量的增加與此有關。IL-1β也可刺激腎系膜細胞合成與釋放PG。IL-1β促使系膜細胞、成纖維細胞、內皮細胞、細胞外基質增殖，引起腎小球基質膨脹，最終導致腎小球硬化，并產生腎臟的慢性炎癥[2]。

第2、8周末模型組中ET-1和IL-1β均高于正常組和假手術組，舒血寧注射液組，銀杏達莫注射組均能夠顯著降低ET-1和IL-1β在模型組中的含量（P＜0.05），但并不能全部降低至正常組水平。金納多注射液組可以將ET-1和IL-1β的水平降低至正常組水平，二者間無顯著性差異（P＞0.05）。同時，隨著病情的發展，第8周模型組血清、尿液、腎臟組織中ET-1和血清IL-1β的含量均高于第2周模型組的含量，表明糖尿病腎病發生時，如不及早干預，炎癥介質會增加含量，發展嚴重的可能。第2周末，DN組血清中ET-1、IL-1β均呈正相關（P＜0.05），相關系數r=0.79；第8周末，DN組血清中ET-1、IL-1β均呈正相關（P＜0.05），相關系數r=0.83。說明糖尿病腎病大鼠血清中ET-1和IL-1β存在著相互作用，二者間可能通過發揮糖尿病腎病炎癥作用。

筆者認為DN的發病機理比較復雜，是多種因素一起作用的結果。大量實驗研究表明，ET-1、IL-1β在DN發病過程中發揮重要的作用。銀杏提取物針劑由于其有效成分對糖尿病腎病的藥理作用，逐漸引起國內外學者重視。本實驗比較不同銀杏提取物針劑對糖尿病腎病大鼠的ET-1、IL-1β水平影響，其中，金納多注射液作用更優，但各銀杏葉提取物組間比較，無顯著性差異（P＞0.05）。

[1] 顧江萍,趙玲,栗德林.水蛭對糖尿病腎病大鼠內皮素-1水平的影響[J].中成藥,2007,29(10):1421-1422.

[2] 戎健,邱鴻鑫.細胞因子、細胞生長因子與糖尿病微血管病變.《國外醫學》內分泌學分冊,1996,16(3):125-126.

R587.2

B

1671-8194（2013）34-0070-02