大孔吸附樹脂純化鬼針草總黃酮的工藝優選

瞿 慧 曹 園* 方祝元 劉志輝

（南京中醫藥大學附屬江蘇省中醫院，南京 210036）

大孔吸附樹脂純化鬼針草總黃酮的工藝優選

瞿 慧 曹 園* 方祝元 劉志輝

（南京中醫藥大學附屬江蘇省中醫院，南京 210036）

目的 優選大孔樹脂純化鬼針草總黃酮的工藝條件。方法 以鬼針草總黃酮的吸附率和洗脫率為指標，通過靜態吸附試驗比較不同種大孔樹脂對鬼針草總黃酮的吸附能力，篩選出合適的大孔樹脂型號；通過單因素試驗優選鬼針草總黃酮的純化工藝參數。結果 HPD400型大孔樹脂純化效果最好，其最佳工藝參數為藥液中質量濃度0.5 mg/mL，pH =4.0，吸附速率2 BV/h，用9 BV 60%乙醇洗脫，洗脫速率3 BV/h，經大孔樹脂純化后鬼針草提取液中總黃酮純度由原來的24.47%提高至58.41%。結論 HPD400型大孔樹脂適用于鬼針草總黃酮的純化，優選的純化工藝穩定可行。

鬼針草；總黃酮；大孔樹脂

鬼針草藥用歷史悠久，始載于《本草拾遺》，全草入藥，味苦而無毒，歸肺、胃、大腸、膽經，具有清熱解毒，活血散瘀消腫之功效，多用于瘧疾、痢疾、肝炎、急性腎炎、咽喉腫痛、跌打損傷、蛇蟲咬傷等[1]。近年來，鬼針草藥材臨床用于治療原發性高血壓、高胰島素血癥、糖尿病等，療效確切[2-4]。其化學成分包括黃酮類、聚炔類、香豆素類、生物堿類、有機酸及其酯等，而黃酮類成分為其主要的活性成分[5-7]。本課題組前期的研究亦表明鬼針草含有豐富的黃酮類成分。本實驗通過比較研究不同種樹脂對鬼針草總黃酮吸附性能，篩選出較為適合的大孔樹脂型號，并探索其分離純化鬼針草總黃酮的工藝條件，為鬼針草的進一步開發利用提供參考和依據。

1 材 料

Cary50紫外分光光度計（Varian，美國），BP-211D型電子分析天平（Satorius Co.Ltd.，德國），WH-2震蕩儀（上海瀘西分析儀器），W5-100SP型恒溫水浴鍋（上海申生科技有限公司）。

鬼針草采自南京東郊中山陵，經中國藥科大學王強教授鑒定為菊科鬼針草屬植物鬼針草（Bidens bipinnata L.）的干燥地上部分；對照品蘆丁為實驗室自制，結構經NMR數據及文獻對比確證，HPLC-UV面積歸一化法計算純度在98%以上；水為蒸餾水，其它試劑均為分析純；AB-8樹脂，天津南開大學化工廠；D101樹脂，天津農藥股份有限公司；HPD100、HPD400、HPD600樹脂，河北滄州寶恩化工有限公司；SP825樹脂，北京惠德易科技有限公司。

2 方法與結果

2.1 總黃酮含量測定[8-9]

精密稱取蘆丁對照品（120℃干燥至恒重）25.2 mg，置于50 mL量瓶中，加60%乙醇超聲溶解，冷卻至室溫后定容至刻度，制成0.504 mg/mL的蘆丁對照品溶液。精密吸取蘆丁對照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分別置于50 mL容量瓶中，加60% 乙醇10 mL，搖勻，加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻后靜置6 min，加入10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻后靜置6 min，加入4%氫氧化鈉試液10.0 mL，并用60%乙醇定容至刻度，搖勻后靜置15 min。同法配制空白對照液，按紫外-可見分光光度法，測定505 nm波長處的吸光度（A），以質量濃度（C）為橫坐標，A為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：A=0.0121C-0.0138，r=0.9996，表明蘆丁在10.08～100.8 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2 樹脂類型的選擇

2.2.1 樹脂預處理：稱取AB-8、HPD100、HPD400、HPD600、D101、SP825型大孔樹脂各50 g，分別用95%乙醇浸泡24h后濕法裝柱，用95%乙醇洗滌，至流出液加5倍量水不渾濁為止，后用凈水充分淋洗至無乙醇味；用2BV的5%HCL溶液，以4～6BV/h的流速洗滌，并浸泡2～4h，而后用水以同樣流速洗至出水pH中性。再用2BV的2%NaOH溶液，以4～6BV/h的流速洗滌，并浸泡2～4h，而后用水以同樣流速洗至出水pH中性。最終置于密閉容器中，備用[10]。

2.2.2 鬼針草總黃酮提取液的制備：取石油醚（60～90℃）脫脂后的鬼針草粗粉適量，以15倍藥材量的60%乙醇進行回流提取，提取3次，每次1h，合并醇提液，濾過減壓回收乙醇至無醇味，補充適量水一定體積，搖勻，備用。

2.2.3 靜態吸附及洗脫試驗：取處理后的AB-8、HPD100、HPD400、HPD600、D101、SP825型濕樹脂（用濾紙吸干表面水）各5g，加至100mL具塞三角瓶中，加入1.875mg/mL鬼針草總黃酮提取液60mL，25℃恒溫振蕩24h，過濾，分別吸取各樹脂吸附后藥液6.0mL，按2.1項下方法于505nm處測定A，計算各樹脂對鬼針草總黃酮的吸附率。將靜態吸附后的樹脂抽濾至不滴水為止，加入250mL具塞三角瓶中，于室溫條件下加入75%乙醇100mL洗脫，25℃恒溫振蕩24h，過濾，分別吸取各洗脫液10.0mL，按2.1項下方法于505nm處測定A，計算各樹脂對鬼針草總黃酮的洗脫率，結果見表1。

表1 6種大孔樹脂對鬼針草總黃酮的吸附率與洗脫率

由表1可知，各種樹脂對鬼針草總黃酮吸附能力的大小順序為：HPD400＞HPD600＞D101＞SP825＞HPD100＞AB-8；洗脫率大小依次為：HPD400＞D101＞AB-8＞HPD100＞SP825＞HPD600，故選用HPD400作為鬼針草總黃酮純化用樹脂。計算公式如下[11]：

吸附率=（C0V0-C1V1）/C0V0

洗脫率=C2V2/（C0V0-C1V1）×100%

純度=（m2/m1）×100%

式中C0表示起始提取液中總黃酮質量濃度，C1表示吸附24h后溶液中總黃酮質量濃度，C2表示洗脫液中總黃酮質量濃度，V1表示提取液體積，V2表示洗脫液體積，m1表示洗脫液干燥后固體的稱樣量，m2表示洗脫液中總黃酮的測定量。

2.3 HPD400型大孔吸附樹脂純化工藝優選

2.3.1 上樣質量濃度考察：取已預處理的HPD400型吸附樹脂6份，每份10g，濕法裝柱（2.0cm×28.0cm），分別加入鬼針草總黃酮提取液0.1、0.3、0.5、0.7、1、1.5mg/mL，以2BV/h流速進行吸附，分別收集過柱液并記錄體積，于505nm處測定A，計算吸附率分別為73.69%，76.85%，80.54%，62.71%，55.36%，43.67%。說明對于一定量的溶質來說，上樣液濃度增大，樹脂對溶質的物理吸附作用和化學吸附作用均增強，吸附效果也更好；但上樣液濃度過高，導致吸附選擇性降低、黃酮提早泄漏，所以必須選擇適宜的上樣濃度，確定為0.5mg/mL。

2.3.2 上樣流速對吸附的影響：在上樣液質量濃度0.5mg/mL，考察上樣流速分別為1、2、3、4、5、6BV/h的影響，結果總黃酮吸附率分別為81.67%，79.54%，70.59%，60.97%，56.35%，43.55%。表明隨著上樣液流速的增加，HPD400型大孔樹脂的吸附率下降。由于吸附與脫附是一個動態平衡過程，在一定的吸附速度下加快流速使吸附時間相對減少，泄露點提前，而流速太慢又耗時，故選定2BV/h。

2.3.3 上樣液pH對吸附的影響：在上樣液質量濃度0.5mg·mL-1和上樣流速為2BV/h的條件下，考察上樣液pH分別為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0時，HPD400型大孔樹脂對鬼針草總黃酮吸附率的影響，結果分別為81.17%，88.78%，82.30%，80.47%，76.19%。說明酸性介質利于鬼針草總黃酮的吸附，因為其具有酚羥基，顯弱酸性。但pH=3.0時不升反降，推測是黃酮類化合物形成钅羊鹽而不易被吸附。故上樣pH選定4.0。

2.3.4 上樣量的考察：在上樣液質量濃度0.5mg/mL，pH4，流速為2BV/h的條件下，考察樹脂與生藥量重量比為1∶0.25、1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶3時，HPD400型大孔樹脂對鬼針草總黃酮的吸附率分別為82.60%，86.79%，88.53%，71.27%，57.86%，說明隨著上樣量的增大，樹脂對總黃酮的吸附量也逐漸增大，但當樹脂達到了飽和吸附時，繼續增加上樣量，就有黃酮泄露。因此，鬼針草提取液的最佳上樣量（樹脂∶生藥量）為1∶1。

2.3.5 洗脫劑濃度的考察：按照樹脂與生藥量之比為1∶1加入上樣液，藥液濃度0.5mg/mL，上樣速度為2BV/h，依次加水及體積分數30%、40%、50%、60%、75%、95%乙醇洗脫，分別洗至無色，收集各部分洗脫液，測定總黃酮純度分別為40.49%、46.81%、53.22%、61.29%、47.01%、42.72%，總黃酮的洗脫率分別為57.72%、69.16%、81.13%、90.27%、80.05%、70.96%。說明隨著乙醇體積分數的不斷增加，總黃酮的解析率不斷上升，而當體積分數＞60%，總黃酮的解析率反而有所下降，可能是因為乙醇濃度增加，黃酮的溶解性減弱，且洗脫的脂溶性雜質也增加。因此選用60%乙醇為洗脫劑較為適宜。

2.3.6 洗脫劑用量的考察：按照樹脂與生藥量之比為1∶1加入上樣液，藥液濃度0.5mg/mL，上樣速度為2BV/h，依次加水及體積分數60%乙醇洗脫，每1.5BV收集1次，測定每次收集液中總黃酮質量濃度（圖1）。結果當60%乙醇用量為9BV時，收集液中已基本檢測不出總黃酮，因此60%乙醇用量選9BV。

圖1 鬼針草總黃酮洗脫劑用量考察

2.3.7 解吸附流速的考察：采用60%乙醇為洗脫劑，考察洗脫速度分別為1、2、3、4、5BV/h對鬼針草總黃酮洗脫率的影響，結果分別為93.04%、91.75%、90.10%、76.52%、65.33%。說明隨著洗脫流速的加快，總黃酮的洗脫率呈下降趨勢。對于一定量的洗脫液，加快流速，會使洗脫液與樹脂作用時間相對縮短，從而使解析率下降。但流速過慢，又會延長工作周期。因此選擇洗脫劑流速3BV/h。

2.4 驗證實驗

取已預處理的HPD400型吸附樹脂4份，每份10g，濕法裝柱，將4份鬼針草提取液，每份30mL，調pH至4.0，分別加至樹脂柱，按優選工藝進行試驗，計算總黃酮質量濃度。結果吸附率分別為88.61%、87.26%、87.35%；洗脫率依次為91.13%、90.71%、92.20%。另取提取液、洗脫液各20mL，檢測其中總黃酮的質量濃度。結果原鬼針草提取液中總黃酮的純度為24.47%，3次驗證試驗總黃酮純度分別為57.89%、58.26%、59.07%，經大孔樹脂純化后，總黃酮純度提高了約33.94%，說明該工藝穩定，產品質量可控。

3 討 論

通過靜態吸附試驗，比較了6種不同型號大孔樹脂對鬼針草總黃酮的吸附性能，篩選出HPD400型大孔樹脂為最佳鬼針草總黃酮分離純化的大孔樹脂。這是因為鬼針草總黃酮為黃酮苷元及苷的混合物，所以中等極性樹脂HPD400的吸附性好，解析率也高。

在對HPD400型樹脂動態吸附鬼針草總黃酮特性進行研究的基礎上，確定HPD400型大孔樹脂純化鬼針草總黃酮的最佳工藝參數為上樣質量濃度0.5mg/mL，pH 4.0，上樣速率2BV/h；洗脫劑為60%乙醇，洗脫流速3BV/h，洗脫劑用量9BV。

由于鬼針草含有大量的葉綠素，故提取液經石油醚萃取后，再經過HPD400型大孔樹脂純化，可以獲得更高純度的鬼針草總黃酮，也利于樹脂柱的再生和重復利用。

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Optimization of Purification Technology for Total Flavonoids in Bidens bipinnata by Macroporous Adsorption Resin

QU Hui, CAO Yuan*, FANG Zu-yuan, LIU Zhi-hui
(The Affiliated Jiangsu TCM Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210036, China)

Objective To optimize purification technology of total flavonoids in Bidens bipinnata by macroporous resin. Method With adsorption rate and desorption rate of total flavonoids as indexes, adsorption property of six different kinds of macroporous resins for total flavonoids in B. bipinnata was compared by static adsorption and desorption experiments, in order to select optimum macroporous resin. Single factor test was used to investigate adsorption and elution conditions of macroporous resin. Result HPD400 macroporous resin presented the best effect of purification. Its optimum purification parameters were as followings: the sample concentration 0.5 g/L,pH 4,sample flow rate 2 BV/h,eluted with 9 BV 60% ethanol at 3 BV/h. After purification by macroporous resin, purity of total flavonoids in ethanol extract of B. bipinnata would be increased from 24.47% to 62.33%. Conclusion HPD400 macroporous resin was among the most suitable one for purification of total flavonoids in B. bipinnata. Optimized purification technology was stable and feasible.

Bidens bipinnata; Total flavonoids; Macroporous resin; Purification

R944

B

1671-8194（2013）34-0067-03

江蘇省科技廳社會發展項目（BE2009696）江蘇省中醫藥局科技項目（LZ11002）

*通訊作者：E-mail：caoy2002@126.com.