凝膠法和動(dòng)態(tài)濁度法在b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗細(xì)菌內(nèi)毒素控制中的應(yīng)用比較

馬 平 馬國榮 吳菊壽 齊 娟 杜送田

（蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司，甘肅 蘭州 730046）

凝膠法和動(dòng)態(tài)濁度法在b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗細(xì)菌內(nèi)毒素控制中的應(yīng)用比較

馬 平 馬國榮 吳菊壽 齊 娟 杜送田

（蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司，甘肅 蘭州 730046）

目的 在b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗生產(chǎn)過程中采用凝膠法和動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)中間品、原液和成品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量，以此控制熱原，提高制品質(zhì)量，并對(duì)兩種方法進(jìn)行比較。方法 采用《中華人民共和國藥典》（2010年版）三部附錄Ⅻ E細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中的凝膠法和動(dòng)態(tài)濁度法。結(jié)果 Hib中間品、原液及成品經(jīng)凝膠法和動(dòng)態(tài)濁度法測(cè)定，內(nèi)毒素含量均＜25EU/μg、5EU/μg、25EU/劑，符合規(guī)定。結(jié)論 各項(xiàng)檢定結(jié)果表明：應(yīng)用動(dòng)態(tài)濁度法和凝膠法檢測(cè)b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗中間品、原液和成品細(xì)菌內(nèi)毒素含量結(jié)果相符，動(dòng)態(tài)濁度法定量檢測(cè)對(duì)于內(nèi)毒素含量?jī)?nèi)控指標(biāo)有很好的指導(dǎo)意義。

凝膠法；動(dòng)態(tài)濁度法；b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗

細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外層上的特有結(jié)構(gòu)，內(nèi)毒素為外源性致熱原，它可激活中性粒細(xì)胞等，使之釋放出一種內(nèi)源性熱原質(zhì)，作用于體溫調(diào)節(jié)中樞引起發(fā)熱,是制藥工業(yè)污染的主要因素，因此細(xì)菌內(nèi)毒素檢查（BET）是藥品質(zhì)量控制中的一項(xiàng)重要指標(biāo)[1]。因此，生物制品必須經(jīng)過細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)試驗(yàn)合格后才能使用。為保證b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗質(zhì)量，在生產(chǎn)過程和成品檢定中，使用凝膠法來判定產(chǎn)品內(nèi)毒素檢測(cè)是否合格，用動(dòng)態(tài)濁度法來定量細(xì)菌內(nèi)毒素含量，以此來確定該制品細(xì)菌內(nèi)毒素內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)限值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品：中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：200965。凝膠法鱟試劑湛江安度斯生物有限公司，靈敏度0.25EU/ mL，批號(hào)：120971。動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)：1208102。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)：1304260。

1.1.2 設(shè)備：BET-32M，天津市天大天發(fā)科技有限公司；HH·W21-420BS數(shù)顯電熱恒溫水溫箱，上海科恒。

1.1.3 供試品：精制b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗莢膜多糖、b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液、b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗成品，均有蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司菌苗三室生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)毒素限值的確定：根據(jù)《中華人民共和國藥典》（2010年版）藥品、生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）按以下公式確定：L=K/ M，式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，以EU/mL表示。K為人每千克體質(zhì)量每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/（kg·h）表示，注射劑K=5EU/（kg·h）。M為人用每千克體質(zhì)量每小時(shí)的最大供試品劑量，以mL/（kg·h）表示。

1.2.2 確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）：指在試驗(yàn)中供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)。用以下公式計(jì)算：MVD=cL/λ，式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，c為供試品溶液的濃度。λ為在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度（EU/mL）或在動(dòng)態(tài)濁度法中所使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低的內(nèi)毒素濃度。

1.2.3 凝膠法：鱟試劑靈敏度復(fù)核：取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解后制成2.0λ、1λ、0.5λ、0.25λ四個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，取復(fù)溶后的0.1mL/支規(guī)格的鱟試劑10支，將其中8管排成4列，每列2管，分別加入2.0λ、1λ、0.5λ、0.25λ的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，另外2管加入0.1mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對(duì)照。觀察并記錄結(jié)果。干擾試驗(yàn)用Hib精制多糖、原液、成品各3批進(jìn)行。凝膠限度試驗(yàn)：按表1制備溶液A、B、C、D。使用稀釋倍數(shù)為MVD并且已經(jīng)排除干擾的供試品溶液來制備溶液A和B。按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。

表1 凝膠限度試驗(yàn)

1.2.4 動(dòng)態(tài)濁度法：標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn)：用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，混合30 min，然后逐級(jí)稀釋至內(nèi)毒素為EU/mL的至少3個(gè)濃度的稀釋液，取以上標(biāo)準(zhǔn)品液各0.1mL分別加入預(yù)先加有0.1mL鱟試劑的反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻，同時(shí)做2支陰性對(duì)照管。供試品動(dòng)態(tài)濁度法定量測(cè)定：將Hib精多糖溶解為1μg/mL的溶液，原液稀釋至多糖含量為1μg/mL，成品直接測(cè)定。

2 結(jié) 果

2.1 內(nèi)毒素限值的確定：根據(jù)《中華人民共和國藥典》（2010 年版）中有關(guān)b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗細(xì)菌內(nèi)毒素的規(guī)定，精多糖細(xì)菌內(nèi)毒素應(yīng)不高于25EU/μg，原液細(xì)菌內(nèi)毒素應(yīng)不高于5EU/μg，成品細(xì)菌內(nèi)毒素每1次人用劑量應(yīng)不高于25EU。

2.2 確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）

2.3 鱟試劑靈敏度復(fù)核：陰性對(duì)照管結(jié)果為陰性，實(shí)驗(yàn)有效。λc=0.25EU/mL，在0.5λ-2λ即0.125和0.5EU/mL之間，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)識(shí)靈敏度λ=0.25EU/mL為該批鱟試劑的靈敏度。結(jié)果顯示該鱟試劑靈敏度符合要求。

2.4 干擾試驗(yàn)：結(jié)果見表2。溶液A和陰性對(duì)照D的所有平行管都為陰性，并且C的結(jié)果在鱟試劑靈敏度復(fù)核范圍內(nèi)，結(jié)果顯示三批多糖、原液、成品中均無對(duì)試驗(yàn)造成干擾的物質(zhì)，試驗(yàn)有效。

2.5 凝膠限度試驗(yàn)：陰性對(duì)照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對(duì)照溶液B的平行管均為陽性，陽性對(duì)照溶液C的平行管均為陽性，試驗(yàn)有效。溶液A的兩個(gè)平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定。

表2 干擾試驗(yàn)（凝膠法）

2.6 動(dòng)態(tài)濁度法標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線：lgT=2.9877+（-0.32011 lgC），|r|=0.9924＞0.9800。陰性對(duì)照的反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間，變異系數(shù)CV%＜10%，試驗(yàn)有效。

2.7 干擾試驗(yàn)：部分結(jié)果見表3。λm=0.25EU/mL，供試品以3個(gè)稀釋度進(jìn)行干擾試驗(yàn)，變異系數(shù)均＜10%，回收率在50%～200%之間，符合藥典規(guī)定，在此試驗(yàn)條件下供試品溶液不存在干擾作用。供試品在100倍稀釋情況下，回收率最接近100%，選擇此稀釋倍數(shù)為供試品檢查法時(shí)的稀釋倍數(shù)。

稀釋倍數(shù) 外加內(nèi)毒素 EU/mL 反應(yīng)時(shí)間 s 變異系數(shù) cv 回收率rc（%）實(shí)測(cè)內(nèi)毒素 EU/mL 原液含量 EU/mL

表3 干擾試驗(yàn)（動(dòng)態(tài)濁度法）

2.8 供試品內(nèi)毒素含量定量檢測(cè)：標(biāo)準(zhǔn)曲線：lgT=2.97747+（-0.177667：lgC）相關(guān)系數(shù)：|r|=0.9985＞0.980，符合規(guī)定。Hib精多糖內(nèi)毒素含量均＜25EU/μg，原液內(nèi)毒素內(nèi)毒素含量均小5EU/μg及成品內(nèi)毒素均＜25EU/劑。結(jié)果見表4。

表4 b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定結(jié)果比較

3 討 論

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是用鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝聚反應(yīng)的機(jī)制，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素是 否符合規(guī)定的一種方法。該法與熱原法比較具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)過程短，且可完成多批次供試品檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[2]。供試品用兩種方法檢測(cè)，結(jié)果相符，均小于內(nèi)毒素限值，細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)?zāi)z定性法與動(dòng)態(tài)濁度定量法，都是藥典規(guī)定的方法，凝膠定性法只能判定結(jié)果是否符合法規(guī)要求，而動(dòng)態(tài)濁度定量法可以可以測(cè)出產(chǎn)品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量，以此作為參考，可以不斷提高產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，保證產(chǎn)品質(zhì)量。

[1] 王思理,胡冠時(shí),貢立青.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法及其應(yīng)用[M].北京:氣象出版社,2002:38-81.

[2] 王璐,張紅宇,劉勤.凝膠法和光度法測(cè)定燈盞花素注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量[J].昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,31(2):39-43.

Comparison of Gel-clot Test and Kinetic Turbidinetric Method Application in the Control of Bacterial Endotoxin in Hib

MA Ping, MA Guo-rong, WU Ju-shou, QI Juan, DU Song-tian
(Lanzhou Institute of Biological Products Co.Ltd, Lanzhou 730046, China)

Objective To detect the content of bacterial endotoxin in the intermediate, final bulk and finishied products of haemophilus type B conjugate vaccine with Kinetic turbidinetric method and gel clot test for the control of pyrogen and improving the quality of the products .Meanwhile compare with two methods. Method According to the Methods of Detection of Bacterial Endotoxin in the AppendixⅫE of The Pharmacopoeia of the People’s Republic of China of the year 2010 edition.Results The detection limit for acterial endotoxin of the intermediate,final bulk and finishied products of Hib defined 25EU/μg、5 EU/μg、25 EU/dose,in accordance with the provisions. Conclusion The results of the tests indicate that application of kinetic turbidinetric method and gel clot test for detection of Haemophilus influenza type B conjugates vaccine intermediates,final bulk and finished products in accordance with the results of the content of bacterial endotoxin,quantitative Kinetic turbidinetric method is a good guidance for endotoxin content of internal control index.

Gel-clot test; Kinetic turbidinetric method; Haemophilus type B conjugate vaccine

R927

B

1671-8194（2013）34-0017-03