三維試驗檢測耐頭孢他啶銅綠假單胞菌產β－內酰胺酶

陳 紅（湖南省益陽市第三人民醫院檢驗科 413000）

銅綠假單胞菌為專性需氧非發酵革蘭陰性桿菌，廣泛存在于自然環境中，是醫院及社區感染中常見病原菌，可引起包括皮膚軟組織感染、肺炎、敗血癥等在內的多種疾病［1］。近年來，隨著廣譜抗菌藥物廣泛使用，銅綠假單胞菌多重耐藥現象日趨嚴重。有研究表明，銅綠假單胞菌產生各種產超廣譜β－內酰胺酶（ESBLs），是其對β－內酰胺類抗菌藥物耐藥的重要機制［2］。為了解本院銅綠假單胞菌產β－內酰胺酶現狀，本研究對2009年6至2012年5月本院臨床標本中出現的耐頭孢他啶銅綠假單胞菌采用改良三維試驗檢測其β－內酰胺酶，報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2009年6月至2012年5月本院臨床標本中分離的耐頭孢他啶銅綠假單胞菌非重復菌株65株。

1.2 試劑 M－H培養基干粉購自英國Oxoid公司，克拉維酸（CLA）、氯唑西林（CLO）購自中國藥品生物制品檢定所，其余所有藥敏紙片均購自英國Oxoid公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定及藥敏試驗 各臨床科室送檢標本經培養后取可疑菌落按《全國臨床檢驗操作規程》（第3版）進行操作鑒定。藥敏試驗采用K－B法，結果判定參照2012年美國臨床實驗室標準化協會標準執行。以大腸埃希菌（ATCC 25922）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）為標準質控菌株。

1.3.2 改良三維試驗檢測ESBLs、AmpC和金屬酶 三維試驗參照文獻［3］并進行改良。酶粗提物制備：取純培養菌落2～3個，涂在1/4M－H平皿上37℃孵育過夜；刮下菌苔于1mL生理鹽水中，4℃，4 000r/min離心20min后棄上清液，加入700μL生理鹽水于EP管中，－20℃保存，反復凍融6次，4℃，12 000r/min離心20min，上清液經常規細菌培養結果為陰性后，置－20℃保存備用。三維試驗：取2個M－H平皿，分別均勻涂布0.5麥氏單位大腸埃希菌（ATCC 25922），平皿中央分別貼30μg頭孢噻肟和亞胺培南，距離紙片邊緣5mm處打孔，貼頭孢噻肟的平皿分別加45μL酶粗提液加5μL生理鹽水、45μL酶粗提液加5μL 2mmol克拉維酸、45μL酶粗提液加5μL 2mmol氯唑西林、45μL酶粗提液加5μL 2mmol克拉維酸加5μL 2mmol氯唑西林；貼亞胺培南的平皿分別加45μL酶粗提液加5μL生理鹽水、45μL酶粗提液加5μL 0.5 mol乙二胺四乙酸（EDTA）于孔中，避免酶粗提液溢出孔外，35℃溫箱孵育過夜。孔與抑菌圈交界處出現擴大的長菌區域，表明該酶能水解頭孢噻肟或亞胺培南，同時觀察能否被CLA、CLO和EDTA所抑制。以陰溝腸桿菌為陽性對照，以大腸埃希菌（ATCC 25922）為陰性對照。

2 結 果

2.1 藥敏試驗 65株耐頭孢他啶銅綠假單胞菌藥敏試驗結果 見表1。

表1 65株耐頭孢他啶銅綠假單胞菌藥敏試驗（%）

2.2 改良三維試驗測定65株耐頭孢他啶銅綠假單胞菌 見表2。65株耐頭孢他啶銅綠假單胞菌中，單產ESBLs 30株，單產AmpC酶4株，同時產ESBLs和AmpC酶10株，同時產ESBLs和金屬酶15株，同時產AmpC酶和金屬酶2株，產其他β－內酰胺酶4株。

表2 65株耐頭孢他啶銅綠假單胞菌藥物敏試驗結果

3 討 論

頭孢他啶是治療銅綠假單胞菌感染的一線藥物。近年來，隨著β－內酰胺類抗菌藥物的廣泛應用，銅綠假單胞菌對頭孢他啶的耐藥性明顯上升，且常因對多種抗菌藥物耐藥而導致治療失敗，已成為臨床抗感染治療的棘手難題。由表1可見，耐頭孢他啶的銅綠假單胞菌通常伴有其他多類抗菌藥物耐藥。目前引起臨床關注的β－內酰胺酶有：ESBLs、AmpC、對酶抑制劑敏感性下降的β－內酰胺酶（IRTs）、金屬酶和非金屬酶的碳青霉烯酶。銅綠假單胞菌對β－內酰胺類藥物耐藥主要產生各種β－內酰酶，它們可定位于質粒或染色體上，對β－內酰酶高度耐藥和酶抑制劑耐藥。在院內感染的監測中，為了便于及時切斷耐藥基因的傳播，監測細菌的產酶機制有十分重要的意義［4］。

改良三維試驗利用ESBLs能被CLA抑制，不被CLO抑制；AmpC酶則不能被CLA抑制，但可被CLO抑制；金屬酶可被EDTA抑制等特性來檢測ESBLs、AmpC酶和金屬酶。采用細菌酶液進行操作，避開細菌外膜滲透機制和抗菌藥物泵出機制對試驗的干擾，因而不受抗菌藥物的誘導、細菌表型和外界因素的影響，可更準確地同時檢測銅綠假單胞菌ESBLs、AmpC酶和金屬酶［5－6］。由表2可見，46.2%（30/65）菌株單產ESBLs，6.2%（4/65）菌株單產 AmpC酶，15.4%（10/65）菌株同時產ESBLs和AmpC酶，23.1%（15/65）菌株同時產金屬酶和ESBLs，3.1%（2/65）菌株同時產 AmpC酶和金屬酶，6.2%（4/65）菌株產其他β－內酰胺酶，這與文獻［3，7－9］報道的有所不同，可能與各地區使用抗菌藥物的種類和頻率不同有關。本研究結果表明，本院耐頭孢他啶銅綠假單胞菌產ESBLs達84.7%，產金屬酶和 AmpC酶分別為26.2%和24.7%，而41.6%的菌株同時產兩種β－內酰胺酶。說明本院分離銅綠假單胞菌不僅產酶高，而且產酶種類較多，可能是對β－內酰胺酶類藥物廣泛耐藥的重要機制，應引起臨床高度重視。

綜上所述，本院耐頭孢他啶銅綠假單胞菌對β－內酰胺酶類藥物耐藥主要與其產ESBLs有關，其次為AmpC酶和金屬酶。控制產酶菌株在本院的播散及流行已刻不容緩，臨床在治療該類細菌感染時，應及時根據藥敏試驗結果合理選用抗菌藥物。

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