苦碟子注射液指紋圖譜的研究

彭振宇 宋玉國 申玉華

苦碟子注射液指紋圖譜的研究

彭振宇 宋玉國 申玉華

目的采用 HPLC法建立苦碟子注射液的指紋圖譜。方法以綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、菊苣酸混合對照品為參照物；色譜柱Phenomenex Luna C18 4.6mm×250mm，5μm；柱溫40℃；檢測波長為327nm；以乙腈-0.4%磷酸溶液系統(tǒng)為流動相進行梯度洗脫，流速0.9ml/min。結(jié)果30批供試品液相色譜圖中，均檢出10個特征峰，相似度不低于0.9。結(jié)論為苦碟子注射液的質(zhì)量評價提供了依據(jù)。

苦碟子注射液；指紋圖譜；高效液相色譜法；木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷

隨著對中藥注射劑的日益關(guān)注，急需建立簡便、實用、全面、有效的質(zhì)量評價體系，中藥材從其化學(xué)成分角度來講，是一個具有多種結(jié)構(gòu)類型成分的化合物庫，因此僅僅通過控制某一指標(biāo)性成分的含量而評價成品的整體質(zhì)量是不充分的。中藥指紋圖譜技術(shù)作為控制和評價中藥材、半成品和成品質(zhì)量的一個有效方法，近年來成為中藥質(zhì)量控制研究的熱點，是國際上公認(rèn)的控制中藥材質(zhì)量的有效手段之一。苦碟子注射液現(xiàn)行國家藥品標(biāo)準(zhǔn)采用高效液相色譜法測定腺苷的含量，其中重要的有效成分黃酮類，僅采用紫外分光光度法測定了總黃酮的含量。根據(jù)文獻報道，苦碟子主要含有三萜、黃酮、倍半萜內(nèi)酯、核苷、香豆素等成分，其中木犀草素、芹菜素類成分，具有明顯擴張冠脈回流量及降低冠脈血管阻力的良好作用，因此，建立以黃酮類化合物為參照的指紋圖譜方法，可有效控制產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量，具有良好的現(xiàn)實意義。苦碟子注射液的有效成分為黃酮類，其中已確定為活性成分的木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷已分離出單體（我所與企業(yè)合作），并確定了結(jié)構(gòu)，另外經(jīng)查閱文獻，苦碟子中含有較多有機酸類成分，故我所篩選了一些黃酮類和有機酸類對照品作為參照進行實驗，摸索建立以黃酮類化合物為特征峰的指紋圖譜測定方法。

1 儀器與試藥

島津 LC-20A高效液相色譜儀；色譜柱：Phenomenex Luna C18（4.6×250mm）。乙腈為色譜純（Fisher公司）；磷酸為色譜純（Fisher公司）；甲醇為色譜純（Fisher公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 參照物溶液的制備取綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、菊苣酸對照品適量，加50%甲醇制成每1ml各含0.05mg混合溶液，即得。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)提取物溶液的制備取本品約0.1g，置25ml量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備取樣品30批，華夏藥業(yè)提供的小樣4批（編號100621hx、100622hx、100623hx、100624hx），作為供試品，雙鼎制藥提供了企業(yè)自制的標(biāo)準(zhǔn)提取物（簡稱標(biāo)提物）。供試品溶液的制備：取本品適量，用0.45μm濾膜濾過，即得。標(biāo)準(zhǔn)提取物制備：取約0.1g，精密稱定，至25ml容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)提取物溶液。

2.2 色譜條件色譜條件：色譜柱Phenomenex Luna C18 4.6mm×250mm，5μm；流動相A為乙腈，B為0.4%磷酸溶液（ml/min），按表1程序進行梯度洗脫，流速0.9ml/min；檢測波長為327nm；柱溫40℃。

表1 流動相程序表

2.3 測定波長的選擇觀察樣品各個波長的色譜圖，在327nm的色譜圖，兩個主峰的峰高均較高，兩峰比例適中，檢出的峰較多，基線比較平整，并且 327nm為有機酸的最大吸收峰，故選擇 327nm為測定波長。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗取一份樣品按照供試品溶液制備方法制備供試品，在上述色譜條件下連續(xù)進樣 6次。結(jié)果共有峰相對保留時間的 RSD值均小于2.0%，相對峰面積比值均小于3.0%，表明此方法精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗依供試品溶液方法平行配制 6份供試品溶液，在上述色譜條件下進行測定。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間的 RSD值均小于2.0%，各共有峰相對峰面積的RSD值均小于3.0%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗取同一份供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24h進行測定。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間的RSD值均小于2.0%，各共有峰相對峰面積的RSD值均小于3.0%，表明本方法穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜測定測定方法：精密吸取上述各類供測溶液，注入高效液相色譜儀，測定。

2.5.1 保留時間的匹配取上述各類供測溶液的高效液相色譜圖，分析及統(tǒng)計，結(jié)果在 10～90min，34批供試品共出峰13個，80%以上樣品所具有的峰規(guī)定為共有峰，共有10個以此作為特征峰，其中對照品相對應(yīng)的有6個，其余4個相對保留時間分別為0.184±1%、0.279±1%、0.40±1%、1.15±1%處。

2.5.2 相對保留時間匹配以木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷為參比峰，分別計算供試品、參照物、標(biāo)準(zhǔn)提取物中各峰與標(biāo)準(zhǔn)峰保留時間的比值（相對保留時間），結(jié)果，30批供試品和4批華夏小樣匹配良好，各特征峰的相對保留時間差距極小，34批樣品最小、最大值之差最大僅為0.003，相同時間段的參照物、標(biāo)準(zhǔn)提取物的相對保留時間也在此范圍內(nèi)。對最小、最大值與均值之差相對于均值的百分率進行了統(tǒng)計，最大偏移僅為1.087%。

3 結(jié)論

將供試品液相色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.1版本），截取保留時間 5～90min圖譜，以供試品指紋圖譜為參照圖譜，設(shè)置全譜匹配參數(shù)為0（即峰面積占總峰面積的0%以上的峰參加匹配），以2、8、9號峰多點校正，全譜峰匹配，時間窗寬度0.3，原始圖譜見圖1，匹配后圖譜見圖 2，生成對照指紋圖譜。結(jié)果以參照圖譜為對照，相似度為0.826～0.998（詳見表2），以對照指紋圖譜為對照，相似度為0.919～0.998。

表2 分析結(jié)果[參照圖譜文件名為：16-Detector A(327nm).cdf]

暫定供試品液相色譜圖（圖3）中，以對照品液相色譜圖（圖4）為對照，應(yīng)檢出綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、菊苣酸，并且以木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷為標(biāo)準(zhǔn)峰，分別在相對保留時間為0.184±1%、0.279±1%、0.40±1%、1.15±1%處檢出峰。將供試品液相色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版本），截取保留時間5～90min圖譜，設(shè)置全譜匹配參數(shù)為0（即峰面積占總峰面積的 0%以上的峰參加匹配），以 2、8、9號峰多點校正，全譜峰匹配，時間窗寬度0.1，計算相似度，不得低于0.90。

圖1 原始圖譜

圖2 匹配后圖譜

圖3 供試品色譜圖

圖4 對照品指紋圖譜

[1] 彭纓,張梅,宋少江.抱莖苦荬菜藥材中木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的分離與測定[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報,2006,23(8)：518-520.

[2] 袁汀,劉蕊,黃曉玲.苦碟子研究進展[J].實用藥物與臨床,2004, 7(4)：44.

[3] 張囡,呂阿麗,王玎,等.苦碟子的化學(xué)成分[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報,2007(9)：549.

Study on HPLC Fingerprint of Kudiezizhusheye

Peng Zhenyu Song Yuguo Shen Yuhua

ObjectiveThe HPLC fingerprints of kudiezizhusheye were established.MethodsUse the chlorogenic acid、caffeic acid、ferulic acid、luteolin-7-O-glucoside、luteolin-7-O-β-D-glucuronopyranoside、cichoric acid as the reference substance;a column of Phenomenex Luna C18 4.6mm×250mm,5μm; Column temperature was 40℃,and 327nm as the detection wavelength; determination was conducted by the gradient elution with acetonitrile and 0.4% phosphoric acid, flow rate at 0.9ml?min-1.ResultsWith 30 batches of test articles, all can detected 10 characteristic peak, the similarity index not less than 0.90.ConclusionThis method can provide basis estimation of quality for kudiezizhusheye.

Kudiezizhusheye; Fingerprints; HPLC; Luteolin-7-O-β-D-glucuronopyranoside

R927.2

A

1673-5846(2013)07-0029-04

吉林省食品藥品檢驗所，吉林吉林 132000