高效分子排阻色譜法測定頭孢米諾鈉聚合物的含量

李 兵 肖甜甜

（吉林省食品藥品檢驗所, 吉林 長春 132000）

高效分子排阻色譜法測定頭孢米諾鈉聚合物的含量

李 兵 肖甜甜

（吉林省食品藥品檢驗所, 吉林 長春 132000）

目的 建立高效分子排阻色譜（HPSEC）法測定頭孢米諾鈉聚合物。方法 采用高效凝膠色譜柱（TSKgel G2500 PWXL 7.8mm ×300mm）；流動相為pH 7.0的0.005mol/L的磷酸鹽緩沖液（0.005mol/L的磷酸氫二鈉：0.005mol/L的磷酸二氫鈉（61∶39））；流速0.5mL/min；檢測波長254nm；進樣量為10μL；自身對照外標法定量。結果 頭孢米諾鈉的線性范圍為2.02～40.36μg/mL（R=0.9999）；定量限為1ng；重復性（RSD）為1.3%（n=5）。樣品測定的線性范圍為0.4～2.5mg/mL（R=0.9995）。結論 該方法能夠較好地分離頭孢米諾鈉和聚合物，簡便快速，定量準確，重現性好，可用于頭孢米諾鈉中聚合物的檢驗。

頭孢米諾鈉；頭孢米諾鈉聚合物；高效分子排阻色譜法

2011年國家藥品評價性抽驗對目前市場上注射用頭孢米諾鈉的59家生產企業的219批樣品進行了抽驗，涉及的63個質量標準有60個缺乏聚合物測定項，且現有的聚合物測定項均采用葡聚糖凝膠G-10為填料的凝膠色譜法，在探索性研究實驗中發現G-10凝膠色譜柱存在柱效低、分離效果差、且聚合物峰易被主峰包裹等缺點，本文參考相關文獻[1-3]，采用近年來日趨成熟的高效分子排阻法建立了頭孢米諾鈉中聚合物的測定方法，經過方法學驗證后對2011年國家評價性抽驗的部分樣品進行檢驗，并對檢驗結果進行了統計分析。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀。

1.2 試藥

頭孢米諾對照品（批號：130508-201003純度：76.9% 來源于中檢所）；供試品為2011年國家評價性抽驗中16家生產企業的78批注射用頭孢米諾鈉（全部為頭孢米諾原料藥直接灌裝，廠家與批號見表6）；乙腈為色譜純。其他試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 色譜條件和系統適用性試驗

色譜柱：TSKgel G2500 PWXL（7.8mm×300mm）（TOSOH Japan）；流動相：pH 7.0的0.005 mol/L的磷酸鹽緩沖液（0.005mol/L的磷酸氫二鈉：0.005mol/L的磷酸二氫鈉（61∶39）；流速0.5mL/min；檢測波長254 nm；進樣量為10μL。

2.2 對照溶液的制備

精密稱取頭孢米諾對照品約20mg置100mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取2.5mL置50mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液（10μg/ mL）。

2.3 測定法

精密稱取供試品約25mg置25mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，立即精密量取10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。另精密量取對照溶液10μL注入液相色譜儀，同法測定。將頭孢米諾主峰前的雜質峰計為聚合物峰，按外標法以峰面積計算，含頭孢米諾聚合物以頭孢米諾計。供試品圖譜見圖1，聚合物保留時間為11.5min，與主峰有效分離。

圖1 頭孢米諾供試品

3 方法學考察

3.1 頭孢米諾對照溶液線性范圍

精密稱取頭孢米諾對照品13.12mg置250mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，為40μg/ mL的溶液，分別精密取5mL、2.5mL、2mL、7.5mL、1mL、2.5mL置10mL、10mL、10m、50mL、10mL、50mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取上述溶液10μL注入液相色譜儀，按“2.1”項色譜條件測定，記錄峰面積。以頭孢米諾對照品的濃度為橫坐標（X），以頭孢米諾峰面積為縱坐標（Y），求得回歸方程：Y=20511X-2005.9（R=0.9999）。結果表明：頭孢米諾濃度在2.02～40.36μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

3.2 頭孢米諾與聚合物的線性關系

取注射用頭孢米諾鈉，精密稱定。用流動相溶解并分別稀釋制成每lmL中含頭孢米諾0.4、0.8、1.0、1.2、1.8、2.5 mg的溶液，搖勻，按“2.1”項色譜條件，精密量取10μL立即進樣分析，記錄色譜圖。以頭孢米諾的濃度為橫坐標（X），以聚合物的峰面積為縱坐標（Y），求得回歸方程：Y=16957X+321.02，R=0.9995。結果表明：頭孢米諾濃度在0.4～2.5mg/mL范圍內與聚合物的峰面積呈良好的線性關系。

精密量取“3.1”項下頭孢米諾對照品溶液（10.09μg/ mL）10μL，重復進樣5次，按“2.1”項色譜條件測定，記錄峰面積。RSD為0.6%，表明精密度良好。

3.3 定量限

精密稱取頭孢米諾對照品25.91mg置25mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1mL置100mL量瓶，加流動相稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1mL置100mL量瓶，加流動相稀釋至刻度，搖勻，精密吸取10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以10倍信噪比計，最小定量限為0.8ng。

3.4 重復性

精密稱取同一批次樣品（海南衛康制藥，批號20110101）約25mg置25mL量瓶中，稱取5份，分別加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密稱取頭孢米諾對照品約20mg置100mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取5mL置100mL量瓶，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液，分別精密吸取上述供試品溶液與對照品溶液10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以外標法計算聚合物的含量。5次實驗聚合物含量的RSD為1.3%，表明重復性良好。

3.5 供試品溶液穩定性

取注射用頭孢米諾鈉（廣東白云山 批號：101062），按“2.3”項配制供試品溶液在室溫25℃放置，分別在0、2、4、6、8、10、24h精密吸取10μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項的色譜條件測定聚合物的峰面積，計算百分含量。結果表明：供試品溶液隨時間延長聚合物迅速增加，穩定性降低，在0、2、4、6、8、10、22小時聚合物分別為0.16%、0.39%、0.59%、0.81%、0.99%、1.11%、1.66%，因此在測定時供試品溶解后應立即進樣。

圖2 高聚物隨時間的變化圖譜

4 樣品測定

照“2.3”項下方法測定16個廠家的78批次樣品的聚合物。聚合物含量最低為0.08%，最高為0.73%，平均含量0.22%。不同廠家的樣品聚合物的含量不同，相同廠家不同批次樣品的聚合物含量不同，離散程度有很大差異。

5 討 論

5.1 流動相種類

采用TSKgel G2500 PWXL色譜柱，分別采用pH 7.0的0.005 mol/L的磷酸鹽緩沖液（0.005 mol/L的磷酸氫二鈉：0.005 mol/L的磷酸二氫鈉（61∶39））-乙腈（95∶5）與0.01 mol/L的醋酸銨（稀氨水調節pH 至7.0）-乙腈（90∶10）兩種流動相測定同一份溶液的聚合物。兩種流動相均能有效分離聚合物峰與頭孢米諾主峰，而pH7.0的0.005mol/L的磷酸鹽緩沖液-乙腈（95∶5）對聚合物與主峰及主峰后面的雜質峰的分離效果更好，故選擇pH 7.0的0.005 mol/L的磷酸鹽緩沖液-乙腈（95∶5）作為流動相。

5.2 改變流動相比例

采用TSKgel G2500 PWXL色譜柱，分別采用pH 7.0的0.005 mol/ L的磷酸鹽緩沖液-乙腈（90∶10）、pH 7.0的0.005 mol/L的磷酸鹽緩沖液-乙腈（95∶5）、pH 7.0的0.005mol/L的磷酸鹽緩沖液三種比例的流動相測定樣品中的聚合物。三種比例的流動相均能有效分離聚合物與頭孢米諾主峰，使用TSKgel G2500 PWXL色譜柱測定聚合物對流動相比例的選擇性較小，隨著有機相比例不斷減少，主峰后面的雜質峰分離度增加，而聚合物峰與主峰的分離度變化不明顯。由于乙腈會對TSKgel G2500 PWXL色譜柱造成一定傷害，所以最好選擇乙腈含量較小的流動相，最終確定pH 7.0的0.005 mol/L的磷酸鹽緩沖液為流動相。

5.3 改變流動相離子強度

采用TSKgel G2500 PWXL色譜柱，分別采用pH 7.0的0.005 mol/ L的磷酸鹽緩沖液、pH 7.0的0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液兩種離子強度的流動相測定樣品中聚合物的含量。兩種離子強度的磷酸鹽緩沖液均能使聚合物與頭孢米諾主峰有效分離，其分離效果沒有明顯區別。最終選擇鹽濃度較低的pH 7.0的0.005 mol/L的磷酸鹽緩沖液為流動相。

[1] 江曉玲.頭抱菌素類抗生素中高分子雜質的研究進展[J].國外醫藥抗生素分冊,2007,28(6):264.

[2] 王雅立,,高丹.頭孢拉宗鈉的聚合物檢查方法的建立與驗證[J].海峽藥學,2010,22(7):70-72.

[3] 晏會根.高效分子排阻色譜法測定頭孢硫脒聚合物含量[J].海峽藥學,2010,22(3):62-64.

R914

B

1671-8194（2013）21-0108-02