急性髓性白血病患者外周血淋巴細胞亞群的檢測及其臨床意義

朱孟霞 許蓮蓉* 張耀方

（山西醫科大學第二醫院血液內科，山西 太原 030001）

急性髓性白血病患者外周血淋巴細胞亞群的檢測及其臨床意義

朱孟霞 許蓮蓉* 張耀方

（山西醫科大學第二醫院血液內科，山西 太原 030001）

目的 探討急性髓系白血病（AML）患者外周血T淋巴細胞亞群、DNT細胞、NK細胞的表達水平及其臨床意義。方法 采用流式細胞術對40例初發AML患者、32例AML完全緩解（CR）患者及20例正常人外周血T淋巴細胞亞群、DNT細胞及NK細胞水平進行檢測。結果 初發AML組與正常對照組比較，CD4+細胞、CD4+/CD8+比值、DNT細胞及NK細胞明顯降低（P＜0.05）；CD3+細胞、CD8+細胞變化不顯著（P＞0.05）。復治CR組與對照組比較，NK細胞明顯降低（P＜0.05），其他各值差異無統計學意義。結論 初發AML患者的T淋巴細胞亞群、DNT細胞、NK細胞變化明顯，而治療緩解后淋巴亞群基本恢復正常，說明T淋巴細胞亞群、DNT細胞、NK細胞水平檢測在評價AML療效及判斷預后方面具有一定的臨床價值。

白血病；髓樣；急性；淋巴細胞亞群；免疫功能

急性髓系白血病（acutemyeloid leukemia，AML）是造血干細胞的惡性克隆性疾病，其發生、發展與機體免疫紊亂有著密切的關系。因此，檢測AML患者淋巴細胞亞群水平對于探討白血病免疫異常及指導治療有重要的意義。本文采用流式細胞術檢測AML患者在初發及完全緩解后外周血T淋巴細胞亞群及自然殺傷（NK）細胞的變化，觀察細胞免疫功能變化并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

①材料：急性髓系白血病患者40例（初發組），均為我院2012年6月至2013年5月住院患者，所有患者均進行MICM分型，診斷標準采用張之南主編的《血液病診斷及療效標準》[1]，排除合并有其他惡性腫瘤以及免疫相關疾病的患者。其中男性22例，女性18例，中位年齡35歲（年齡13～56歲），AML亞型：M1 4例，M2 11例，M3 7例，M4 10例，M5 7例，M6 1例。已經確診并經系統化療達完全緩解的AML患者為復治組共32例，20名健康人（對照組）為我院正常體檢者。三組患者的年齡、性別間具有均衡性。②試劑及儀器：CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5、CD3-FITC/（CD16+CD56）-PE抗體購自美國BD公司。溶血素購自美國Beckman Coulter公司。PBS洗滌液及含1%多聚甲醛的固定液由本實驗室自行配制，離心機及流式細胞儀為美國Beckman Coulter公司產品。

1.2 方法

①標本采集：初發和CR患者均于入院未治療前抽取清晨空腹外周血2mL，對照組隨機抽取清晨空腹外周血2mL，EDTA抗凝，6h內標記抗體。②淋巴細胞亞群檢測方法：采用直接免疫熒光標記法進行單克隆抗體標記，取兩個檢測管標記為N管、T管，分別加入4.5μL單克隆熒光抗體CD3-FITC/（CD16+CD56）-PE及CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5，加入樣本35μL、PBS緩沖液25μL，混勻，室溫下避光作用15min后，加溶血素100μL，混勻，待紅細胞溶解后，用PBS洗滌，1000r/min離心5min，棄上清，最后加500μL固定液，避光靜置30min后上機檢測。

1.3 統計學方法

采用SPSS13.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（χ—±s）表示，多組均數間比較采用方差分析，兩兩檢驗采用SNK-q檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

表1 AML患者及正常對照組外周血淋巴細胞亞群測定結果（%，χ—±s）

2.1 初發組的CD4+細胞、CD4+/CD8+比值較CR組及對照組均降低（P＜0.05），CD3+細胞、CD8+細胞較其他兩組均無明顯差異（表1）。

2.2 初發組的CD3+CD4-CD8-細胞較CR組及對照組均降低（P＜0.05），而CR組與對照組間無明顯差異（P＞0.05）。

2.3 初發組及CR組的CD16+CD56+細胞較對照組均降低（P＜0.05），而初發組與CR組間無明顯差異（P＞0.05）。

3 討 論

細胞免疫功能缺陷、免疫監督不力是腫瘤發生、發展的重要原因之一，研究已經證實急性白血病患者存在淋巴細胞數量減少和功能的缺陷，從而導致腫瘤殺傷能力下降，其中淋巴細胞數量的減少多以CD4+淋巴細胞減少為主[2-3]。

CD4+/CD8+比值反映機體免疫功能的調節能力，其比值平衡是機體維持免疫內環境穩定的中心環節[4]。以往報道中急性白血病患者外周血中CD8+T數據略有差異[5-6]，但總體呈相對增多狀態。本實驗發現，初發AML中CD4+T、CD4+/CD8+比例明顯降低，而CD8+T絕對數量無明顯變化，說明AML患者存在細胞免疫功能失調。治療緩解后的CR組與對照組比較無明顯差別，說明經過系統化療達完全緩解的CR組細胞免疫功能紊亂得到一定修復。研究發現，CD4+/CD8+比例未倒置的患者，經誘導緩解治療階段及移植后療效均明顯優于比例倒置患者[7]。此外，成熟淋巴細胞表達CD4+細胞和CD8+T細胞，而幼稚細胞不表達，因此混入的少量白血病細胞并不影響CD4+/CD8+的比例，具有較高的可信性。

DNT細胞（CD3+CD4-CD8-T）是一種抗原特異性免疫調節T淋巴細胞，具有免疫調節、免疫抑制作用[8]。本研究結果顯示初發AML患者DNT細胞減少，可能導致腫瘤細胞凋亡作用降低致使腫瘤發病。

NK細胞（CD3-CD16+CD56+）是機體防御腫瘤的天然屏障，且CD56是唯一與髓外浸潤相關的表面抗原，同時在白血病髓外浸潤患者中高表達[9]。本研究結果顯示初發組及CR組的CD16+CD56+細胞較對照組降低，說明初發AML患者NK細胞免疫功能明顯受損，而CR后NK細胞免疫功能尚未完全恢復，這與文獻報道基本一致[10]。

綜上所述，初發AML患者淋巴細胞亞群明顯異常，而隨著疾病緩解，細胞數量及比例基本恢復正常，說明細胞免疫功能紊亂得到修復。因此檢測淋巴細胞亞群，對AML患者免疫功能監測以及療效、預后判斷有一定的臨床意義。另外DNT細胞下調免疫應答誘導移植物免疫耐受形成的作用也備受關注，而這種作用的證實仍將進行進一步的跟蹤研究。

[1] 張之南.血液病診斷及療效標準[M].3版.北京:北京科學出版社, 2007:168-376.

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[6] 賈國榮,李志芹.急性髓系白血病患者治療前后T 淋巴細胞亞群測定的臨床意義[J].免疫標記分析與臨床,2011,18(2):76-79.

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[10] Luczyski W,Stasiak-Barmuta A,Kraw czuk-Rybak M,et al.Is cellular immunity not impaired after remission induction in children with acute lymphoblastic leukemia[J].Pol Merkur Lekarski,2004,16 (91):17-21.

Detection of Lymphocyte Subsets in Peripheral Blood of Patients with Acute Myeloid Leukemia and its Clinical Significance

ZHU Meng-xia, XU Lian-rong*, ZHANG Yao-fang
(Department of Hematology, Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China)

Objective To explore the expression and significance of the T cell subsets, DNT cells, NK cells in peripheral blood of patients with acute myeloid leukemia (AML). Methods The different level of peripheral blood T lymphocyte subsets, DNT cells, NK cells of 40 acute myeloid leukemia patients, 32 completely remitted (CR) patients and 20 normal controls were detected with flow cytometry. Results Compared with the normal controls , the percentage of CD4+cells, DNT cells, NK cells and the ratio of CD4+/ CD8+decreased obviously in newly diagnosed AML group (P＜0.05), while the change of percentage of CD3+cells and CD8+cells was not significant(P＞0.05). Compared with the normal controls the percentage of NK cells decreased obviously in CR group (P＜ 0.05).There was no significant difference in other data between CR group and the control group (P＞0105). Conclusion Lymphocyte subsets, DNT cells, NK cells were markedly changed in AML, but recovered essentially to normal after treatment. It shows that detection of T lymphocyte subsets, DNT cells, NK cells are clinically value on evaluation of therapeutic effect and prognosis of acute myeloid leukemia.

Leukemia, Myeloid, Acute; Lymphocyte subsets; Immune function

R733.71

B

1671-8194（2013）21-0032-02

*通信作者：E-mail：xulianrong@sohu.com