甲型流感患者CD4和CD8因子的變化及其臨床意義

龍光艷 劉 梅 王建華 李娜娜 陳 玲*

（遵義醫學院附屬醫院呼吸二科，呼吸醫學研究室，遵義 563003）

甲型流感患者CD4和CD8因子的變化及其臨床意義

龍光艷 劉 梅 王建華 李娜娜 陳 玲*

（遵義醫學院附屬醫院呼吸二科，呼吸醫學研究室，遵義 563003）

目的檢測甲型流感患者外周血CD4及CD8因子，了解CD4+和CD8+T淋巴細胞的動態變化及其臨床意義。方法收集年齡在20～55周歲之間有明顯流感病毒感染癥狀患者的鼻咽拭子，將經流感病毒NP基因片段鑒定確診的甲型流感患者作為研究對象，分別于感染后不同時間段采取外周血，離心取血清，應用雙抗體夾心技術（ELISA）測定流感患者血清中CD4及CD8因子進行檢測及分析。結果經ELISA檢測，顯示經流感病毒NP基因檢測確診的4例甲型流感患者中，所有病例CD4、CD8因子在感染3天時均呈下降或下降趨勢，在感染7d時表達水平逐漸升高；從表達水平觀察，CD4因子表達水平較低，而CD8因子處于較高水平的表達。結論流感病毒感染人體后可導致T淋巴細胞水平的改變，在感染初期1～3d，CD4及CD8因子呈下降或下降趨勢，提示CD4+和CD8+T淋巴細胞功能受到不同程度的抑制；在感染7～14d，CD4及CD8因子表達逐漸升高并可達高峰值，可能參與病毒的清除，在引發機體免疫應答中發揮重要作用。

ELISA；T淋巴細胞；CD4；CD8；流感病毒

近年來，由于新的流感病毒重組變異株的出現，給世界衛生造成實質性的威脅，其中包括2009年的H1N1流感病毒株[1]。甲型H1N1流感病毒基因組由禽流感、豬流感和人流感病毒基因混合而成，是一種新型病毒，并且人類普遍易感[2]。中國衛生部數據顯示，截止2010年1月2日中國地區確診的H1N1病例為12.094萬人，死亡病例為659人[3]。流感疫情暴發的形式越來越復雜，引起了世界范圍的廣泛關注。

在流感病毒感染時，體液免疫和細胞免疫在疾病的嚴重程度及轉歸上都可能發揮著重要的作用[4]。構成機體免疫系統的淋巴細胞主要有T、B淋巴細胞，但機體對抗病毒感染主要是特異性T淋巴細胞免疫反應，人體免疫內環境的穩定是由T淋巴細胞各亞群的比例來進行調節和維持的[5]。T淋巴細胞亞群包括CD4+T和CD8+T，CD4+T細胞的主要功能是輔助抗體的應答，而CD8+T細胞是抗流感病毒細胞免疫的主要效應細胞。在流感病毒感染的急性期，CD4+和CD8+T細胞通過產生細胞因子調節肺部炎癥變化，提示著CD4+和CD8+T可能與流感病毒感染密切相關。本課題用ELISA法對流感患者感染不同時間的外周血CD4、CD8進行動態檢測，了解CD4+和CD8+T淋巴細胞的動態變化及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 對象

選擇2010年10月至2011年2月本院門診確診為流感的患者。納入標準：發熱、咽痛、流涕、鼻塞、咳嗽、咯痰、頭痛、全身酸痛、乏力；部分病例出現嘔吐和/或腹瀉；少數病例僅有輕微的上呼吸道癥狀，無發熱；體征主要包括咽部充血和扁桃體腫大。

1.2 儀器和試劑

酶標儀（BIO-RAD，iMark，美國）；CD4酶聯反應試劑盒（10-25-695）及CD8酶聯反應試劑盒（10-25-696）均為美國R&D公司產品。

表1 CD4、CD8在流感患者不同時間的表達水平（χ—±s，μg/L）

1.3 實驗方法

對符合納入標準的流感患者鼻咽拭子進行病毒RNA的提取及擴增、鑒定；鼻咽拭子甲型流感病毒NP基因片段PCR擴增，凝膠電泳。

NP引物序列：NP-F：5'-AGAGGATGGTGCTTTCTGC-3'NP-R：5'-CCA TCATTCTTATAACTTCTG-3'；PCR擴增反應條件：Step1（1cycle）：95℃2min， Step2（41cycles）： 95℃20S，55℃ 20S，68℃ 1min30S，Step3（1cycle）；68℃7min。

外周靜脈血采集：經鼻咽拭子流感病毒核蛋白NP基因片段鑒定后的患者，在感染3d、7d、14d及2月后（自身正常對照，記為0天）用EDTA處理的采血管分別采取外周血，每次3mL，以3000g離心10min，取上清保存于-80℃冰箱中備用。

流感病毒患者血清CD4及CD8細胞因子檢測：嚴格按儀器和酶聯免疫吸附試劑盒說明書操作。統計處理：采用SPSS 17.0統計分析軟件進行統計學處理，用均數±標準差（χ—±s）表示。

2 結 果

2.1 采集流感樣癥狀患者鼻咽拭子12份（男性5份，女性7份，年齡20～55歲）。

2.2 12份標本經甲型流感病毒NP基因鑒定，篩查出甲型流感病例4例（病例1，2，3，4）。

2.3 血清CD4及CD8細胞因子表達情況

經ELISA檢測，病例1、病例4CD4在感染3d時均呈下降或下降趨勢，4例患者在感染7～14d CD4表達水平有不同程度的升高；其中病例2、病例3及病例4在感染7d CD4的表達水平較高，而病例1在感染14d CD4表達水平較高。病例1及病例4 CD8在感染3d時均表達下降，4例患者在感染7～14d CD8表達水平有不同程度的升高；其中病例2及病例3在感染7d時CD8的表達水平較高，而病例1及病例4在感染14d CD8表達水平較高。從表達水平觀察，CD4因子表達水平較低，而CD8因子處于較高水平的表達。病例1 CD4及CD8分子在感染3d時均表達下降，感染7d逐漸上升，均在感染14d表達達高峰。病例2及病例3 CD4及CD8分子均在感染7d表達達高峰。病例4 CD4及CD8分子在感染3d時均表達下降，感染7d逐漸上升，其中CD4在在感染7d表達達高峰，而CD8在感染14d時表達達高峰，見表1。

3 討 論

成熟的T細胞表達CD4或CD8分子，即CD4+T細胞或CD8+T細胞。CD4和CD8分子的主要功能是輔助TCR識別抗原和參與T細胞活化信號的轉導。因此本實驗通過檢測外周血中C D4及CD8的變化，判斷CD4+和CD8+細胞在流感患者中的表達情況。

動物實驗研究發現感染豬流感H1N1亞型病毒5～6d時CD4+T、CD8+T細胞可達高峰值[5]；但在國內外文獻研究大多數認為流感患者存在T淋巴細胞亞群免疫功能障礙，彭華保等人[6]研究顯示流感患者病程初期（1～3d）CD4+T、CD8+T表現為抑制狀態；并認為，病情越重T淋巴細胞亞群的抑制越明顯，恢復期明顯上升[6-7]。其他相關文獻報道認為在流感感染初期CD4+T細胞呈下降的，之后逐漸升高。本研究顯示，確診的4例甲型流感患者中，從表達水平觀察，CD4因子表達水平較低，而CD8因子處于較高水平的表達。所有病例CD4、CD8因子在感染1～3d時均呈下降或下降趨勢，與以上文獻報道一致，提示著甲型流感患者早期淋巴細胞亞群功能即受損表現為全面抑制狀態；4例病例在隨著病情的恢復在感染7～14d，CD4及CD8因子表達逐漸升高并可達高峰值，提示可能參與病毒的清除，在引發機體免疫應答中發揮重要作用，并且外周血T淋巴細胞亞群的變化對估計病情的轉歸和預后具有重要的作用。4例病例CD4及CD8表達最高值的時間不同，可能與患者的病程進展不同有關。Annette Fox[8]等人研究顯示，CD8+T細胞的激活應答和分化應答是不同的，在輕型流感患者中其表達是快速、短暫的和適度的，但在重癥流感患者中其表達延遲和/或過度的，其研究中60%的重癥流感患者CD8+T細胞計數低于正常值范圍，而其他患者其CD8+T計數值有表達在正常范圍內的、也有高表達以及過度表達的。提示著CD8

+T在甲型流感患者中的表達可能與病情的嚴重程度有關，其具體的作用機制有待進一步研究。總之，本研究顯示，流感感染可導致CD4+和CD8+T淋巴細胞水平的改變，提示著流感患者外周血T淋巴細胞亞群可能在流感病程中發揮著重要作用。流感病毒與T淋巴細胞亞群相互關系的進一步研究，對流感的診斷、治療和預后估計有重要的臨床意義。

[1] Teijaro JR,Verhoeven D,Memory CA.CD4 T cells Direct Protective Responses to Influenza Virus in the Lungs THROUGH Helper-Independent Mechanisms[J].J Virol,2010,84(18):9217-9226.

[2] Novel Swine-Origin Influenza A(H1N1)Virus Investigation Tem, Dawood FS,Jain S,et al.Emergence of a novel swine.origin influenza A(H1N1)virus in humans[J].N Engl J Med,2009,360(25): 2605-2615.

[3] Guo XC.Dynamic variations in the peripheral blood lymphocyte subgroups of patients with 2009 pandemic H1N1 swine-origin influenza A virus infection[J].Virol J,2011,215(8):1-6.

[4] Baluch A,Long Term Immune Responses to Pandemic.Influenza A/H1N1 Infection in Solid Organ Transplant Recipients[J].PLoS ONE,2011,6(2):1-6.

[5] Lange E.Pathogenesis and transmission of the novel swine-origin influenza virus A/H1N1after experimental infection of pigs[J].J Gen Virol,2009,90(9):2119-2123.

[6] 彭華保.重型甲型H1N1流感患者T淋巴細胞亞群變化分析[J].醫學臨床研究,2011,28(6):1092-1093.

[7] 陳穎.重癥甲型H1N1流感患者外周血T淋巴細胞亞群變化的臨床意義探討[J].中國醫科大學學報,2011,40(2):140-143.

[8] Annette Fox,Severe Pandemic H1N1 2009 Infection Is Associated with Transient NK and Deficiency and Aberrant CD8Responses[J]. PLoS ONE,2012,7(2):1-10.

R373.1+3

B

1671-8194（2013）11-0076-02

貴州省優秀科技教育人才省長基金(黔省專合字2010-68)

*通訊作者：lingjuncd@163.com